Ⅳ酶的提取和分离纯化.pptVIP

四 膜的选择 1.透水率： 2.截留率： 3.截留物相对分子量： ㈢离心分离 一 离心机的选择 1.常速离心机：Vmax≤8000r/min； 用于： 2.高速离心机：Vmax≤（1-2.5）×104r/min； 用于： 3.超速离心机：Vmax＝（2.5-12）×104r/min； 用于：生物大分子、 二 离心方法 1.差速离心法：利用密度（质量数）不同的 物质离心速度不同而分离 密度大的物质在离心瓶底部 ，密度小的在上部 2.密度梯度离心法： 3.等密度离心法： ㈣层析分离 一 吸附层析 1.原理：利用各物质在同种吸附剂中扩散速 度不同而分离 2.常用吸附剂： 二 分配层析 1.原理：利用吸附剂与载体的共同作用，各 物质扩散速度不同而分离，比吸附 层析效果好 2.三类：⑴滤纸层析 ⑵ ⑶ 三 离子交换层析 1.原理：利用离子交换剂上柱，以离子键与待分离物结合，再水洗掉杂质，洗脱剂洗脱待分离物，从而得到待分离物，离子键结合稳，效果好 2.几个重要的离子交换剂： 3.几个重要的洗脱剂： ※离子交换剂： 阴离子交换剂：带正电的物质，可吸附阴离子 阳离子交换剂：带负电的物质，可吸附阳离子 ※层析基本操作过程 四 凝胶层析 1.原理：待分离液与凝胶溶液混合上柱，利 用大分子太大，不从凝胶网孔通过 ，而是从凝胶粒子间通过，受阻力 小，沉降快，而小分子小，可从凝 胶网孔通过，在凝胶中受阻力大， 沉降慢而分离分子大小差距大的物 质 2.几种常用凝胶： 五 亲和层析 1.原理：固定相上柱成母体，再用母体活化剂为母 体引入活泼基团，使母体以共价键与待分 离物结合，再水洗、洗脱得待分离物，母 体与待分离物结合稳，效果好 2.固定相： 3.母体活化剂： ※母体：上柱的载体 配体：待分离物 固定相：同母体 ※亲和层析操作过程 固定相选择 固定相活化 层析过程 ㈤电泳分离 ※原理 电泳速率只与Q、r有关（电荷效应、分子筛效应），而Q与PH有关（PH趋近PI时Q最小，反之同理），r与M有关（M大则r大，反之同理） ※ 支持物要求 均匀、阻力小 ※ 电泳方法及原理 一 纸电泳 二 薄层电泳 三 薄膜电泳 四 凝胶电泳（比凝胶层析效果好） 1.凝胶的组成与制作 组成：单体+交联剂+催化剂 制作：三种成分混合溶解即可 2.单体、交联剂与凝胶网孔大小的关系 单体浓度↑→网孔大小↓ 交联剂浓度占5%→网孔最小 3.连续凝胶电泳三连续：单体浓度、PH、缓冲液连续 ※不连续凝胶电泳 1.三个不连续：单体浓度、PH、缓冲液不连 续 2.三种效应：电荷效应、分子筛效应、浓缩 效应 3.三层：样品胶层：最上层，与样品混合 浓缩胶层：样品大多因分子太大浓 缩于此 分离胶层：需分离出的样品通过浓缩层， 聚集于分离胶层 ※不连续凝胶电泳比连续凝胶电泳效果好 ※浓度梯度凝胶电泳 1.定义：上面单体浓度小，网孔大；往下单 体浓度依次增大，网孔依次变小， 增大了分子筛效应，比连续凝胶电 泳效果好 2.特点：分子筛效应大于电荷效应，为主要 效应 3.作用：不同质量数的物质聚于不同的胶层 ，M大的聚于上层，M小的聚于下层 可用于测/比较M ※SDS（ 1.电泳速度只与网孔大小（分子筛效应）有 关原因 SDS与蛋白质结合，破坏三级结构二硫键，与蛋白质形成复合物，该复合物短轴均为18埃左右，长轴与M有关：M越大→长轴越长，长度差距很大， M越大→长轴越长，在凝胶中受到阻力越大，电泳速度越小 2.作用：测M M与电泳速率有关： 可以通过测电泳速率得M ※等电点聚焦电泳 1.原理：两性离子载体加入到电泳池中，两 电极通电后，正极到负极PH依次增 大，不同蛋白质PI不同，PH=PI时的 地方该蛋白质带电量为零，聚集于 此，可用于分离不同的蛋白质 2.两性离子载体： ㈥萃取分离 一 有机萃取 1.原理：利用不同物质在有机溶