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第一篇　组成人体的细胞 第四章 细胞培养 人体是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内（in vivo）的功能活动是十分困难的。但是如果把活细胞拿到体外（in vitro）培养进行观察和研究，则要方便得多。活细胞离体后于模拟体内生理环境等特定的体外条件下，进行孵育培养使之生存并增殖和进行生理活动，这一过程就称为细胞培养（cell culture）或细胞培养技术（cell culture technique）。 第一节 细胞培养概述 一、细胞培养的基本概念 细胞培养是从体内组织取出细胞并在体外模拟体内环境下，使之生存、生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。 二、体外培养细胞的条件模拟 细胞在体外能否生存以及生活质量的好坏严格依赖于所提供的这种人工模拟环境是否与体内的生理环境一致或相似。概括说来，这种人工模拟的生存环境主要包括营养、温度、渗透压、pH等几方面的因素。 （一）营养需求 体外培养细胞时，营养需求是满足其生存、生长增殖的首要条件。而细胞培养基便是在体外培养细胞时供给细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质。 1．细胞对营养的需求 离体培养细胞对营养的需求基本上与在体相同，主要包括氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、蛋白质、脂类等几个方面。 （1）氨基酸既是细胞合成蛋白质的原料，也是细胞重要的能量来源，氨基酸的种类及数量影响着细胞的密度、增殖、活力等诸多方面。几乎所有的细胞均需要下列12种氨基酸：精氨酸、缬氨酸、酪氨酸、组氨酸、色氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、胱氨酸。 （2）用于细胞培养糖类物质主要有葡萄糖和半乳糖，其中以葡萄糖最为多用。糖类物质是细胞最主要的能量来源，同时也是生物合成核酸、氨基酸、脂类物质重要的碳源。 （3）无机盐对于基础培养基渗透压的调节至关重要，同时还对细胞跨膜电位的调节、细胞附着以及一些酶的活性调节具有重要作用。经常添加的无机盐离子主要有钠、钾、镁、磷、钙等。 （4）维生素是诸多细胞代谢活动重要的辅酶，严重影响着细胞的活力与增殖。生物素、叶酸、烟酰胺、核黄素、维生素C、维生素B12、吡哆醇等都是培养基需要添加的成分，尤其以B族的维生素常见。 （5）血清是一个包含大量蛋白以及多种生长因子、激素、氨基酸、糖、胰蛋白酶抑制剂、脂类物质、无机盐、微量元素等的非常复杂的混合物。最常用的血清主要有胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、新生牛血清（newborn calf serum，NCS）、小牛血清（calf serum，CS）、马血清、猪血清以及人血清。 （6）脂肪酸和脂类物质也常有血清提供，尤其被一些特定的细胞系所必需。例如，用于培养胆固醇依赖的杂交瘤的培养基就需要添加一定量胆固醇。 （7）微量元素常被添加给那些无血清培养基，以弥补因未添加血清所造成的微量元素缺失或不足，主要有锌、铜、硒等。其中硒对于清除培养基中的由代谢产生的自由基具有重要作用。 2．培养基 用于细胞培养的培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为天然培养基和合成培养基。 （1）天然培养基：在细胞培养技术发展的早期，所用的细胞培养基多是来自于淋巴液、血浆、血清以及各种组织提取液，常被称为天然培养基。目前最普遍使用的天然培养基是血清，以胎牛血清、新生牛血清和小牛血清最为常见。但这种天然的培养基常被作为添加剂与合成培养基合用，常见的血清添加比例为5%～20%。 （2）合成培养基：是在对细胞培养时所需各种营养仔细研究的基础之上，根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。包括碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。①基本培养基。早期研制的合成培养基单独使用虽能使细胞生存但往往不能很好的生长增殖，需要添加一定量的血清才能成为真正的“完全培养基”，故常将其称为基本培养基，常见的MEM、DMEM、RPMI1640、199等均属此类；②无血清培养基。无血清培养基是一种不需要添加血清就可维持培养细胞存活、生长、增殖的合成培养基。③无蛋白培养基。目前，这种无蛋白培养基的研制是对通过添加植物水解物来代替动物激素、生长因子等的作用来饲养细胞的；④限定化学成分培养基。限定化学成分培养基同样是一种不含动物蛋白的培养基，和无蛋白培养基不同点在于其没有添加植物水解物，而是使用了一些已知结构和功能的小分子化合物。因此，这种培养基的所有成分都是明确的，是目前研究细胞分泌产物的一种最佳培养基。 （二）温度 体外培养的细胞需要在一定的温度条件下才能存活，不同细胞适宜的培养温度常由动物种类所决定。比如，哺乳类动物细胞包括人类细胞的理想培养温度多在36℃～37℃；鸟类细胞适宜的培养温度在38.5℃；昆虫细胞的培养温度在25℃；冷血脊椎