中山大學课件--病毒学研究方法.pptVIP

感染复数对病毒感染的实验结果有很大影响低感染复数时感染不同步 高感染复数时病毒易产生变异 ? 不同的实验要求不同的感染复数 2、活体培养方法 仍有许多病毒缺乏可供其复制的离体细胞培养系统如：乙肝病毒，大多数植物病毒 活体系统还可提供病毒与宿主相互作用的信息免疫反应 致病机理 治疗方法 最常用活体系统之一：鸡胚 鸡胚用于繁殖病毒、制备疫苗 鸡胚的构造和病毒培养 流感病毒 单纯疱疹病毒 病毒在鸡胚中的繁殖流感病毒单纯疱疹病 活体培养方法 免疫缺陷动物(SCID 小鼠）对病毒感染无免疫排斥 可接入人的免疫细胞等，使之具有人的免疫功能，用于研究 HIV、疱疹病毒等与免疫系统的相互关系 SCID：severe combined immunodeficient 二、病毒形态学研究方法 1、光学显微镜 病毒细小，一般光学显微镜下不可见 但有时可见病毒聚集，或衍生形成的包涵体 狂犬病毒包涵体 病毒包含体 昆虫杆状病毒的多角体 2、电子显微镜 噬菌体负染，透射电镜 疱疹病毒感染细胞的超薄切片，透射电镜 新的电镜技术 冰冻电镜 低辐射电镜 冰冻电镜图像重构技术 冰冻电镜解析病毒结构 一种绿藻病毒的冰冻电镜重构 冰冻电镜解析病毒结构 质型多角体病毒冰冻电镜图 X射线晶体学 通过X射线衍射研究病毒中原子、分子的排列 研究可形成晶体的病毒 荧光显微镜 新的荧光显微镜技术用于实时跟踪AAV 入侵的过程 三、免疫学方法 病毒学与免疫学是密切相关的 免疫技术在病毒学中的应用——利用抗原抗体反应的专一性进行：病毒的检测 病毒的鉴定分型 病毒的定量 特异性抗体的监测 常用免疫学技术 血球凝集试验 补体结合试验 酶联免疫吸附试验（ELISA） 免疫印迹试验（Western blot） 免疫荧光组织化学 免疫胶体金标记 免疫共沉淀 血球凝集试验 某些病毒具有与血细胞表面多糖分子结合的蛋白（基团）。如流感病毒，风疹病毒 补体结合试验 游离的补体可导致抗体包被的红血球破裂(溶血) 但当有抗原-抗体复合物存在时，补体就会与抗原-抗体复合物结合，可避免溶血。 由此可检测是否有特定的抗原或抗体存在 补体结合试验：测定特定抗原的量 抗体（抗血清）与待测抗原样品混合 加入一定量的补体 加入包被抗体的红血球 测定溶血 酶联免疫吸附试验（ELISA） 用酶标记的抗体灵敏地定量检测病毒抗原 ELISA: Enzyme linked Immuno-Sorbent Assay A 双抗夹心B 间接法 ELISA检测抗体 A：抗原 E：标记酶 S：低物 四、生化、生物物理与分子生物学方法 生物物理方法：离心技术病毒颗粒分离纯化 病毒颗粒的大小、沉降系数测定 生物化学方法病毒颗粒生物化学组分分析：蛋白质分析 核酸分析 其它组分分析 分子生物学方法举例：病毒反向遗传学方法 从合成基因到合成病毒： 人工合成脊髓灰质炎病毒  病毒学研究方法 病毒培养方法 形态学研究方法 免疫学(血清学)方法 生化、生物物理与分子生物学方法 1、体外细胞培养技术 二十世纪中期动物细胞体外培养技术的建立，极大推动了动物病毒学研究的发展 原代成纤维细胞 建株成纤维细胞 上皮细胞 原代成纤维细胞 建株成纤维细胞 上皮细胞 Pig kidney cells (IBR-S2) growing on Cytodex 1. Vero cells growing on Cytodex 1. 人二倍体细胞培养 接种细胞24小时 接种细胞72小时 收毒第3天 MDCK细胞 Vero细胞培养 接种细胞24小时 接种细胞48小时 接种细胞60小时 Vero细胞接种PEDV病毒病变过程照片 Vero细胞培养 ST细胞 接种细胞24小时 接种细胞48小时 ST细胞 接种伪狂犬病毒病变过程照片 Marc-145 细胞 接种细胞24小时 接种细胞38小时 接种细胞50小时 Marc-145 细胞 接种PRRSV病毒病变过程照片 PK-15 细胞 接种细胞24小时 接种细胞36小时 接种细胞48小时 PK-15 细胞 接种TGEV病毒病变过程照片 MDCK 细胞 接种细胞24小时 接种细胞48小时 接种细胞72小时 MDCK 细胞 接种H9N2病毒病变过程照片 细胞培养技术在病毒学中的应用 病毒生物学定量 病毒克隆化——获得遗传均一的病毒 方便地生产病毒 同步化研究病毒复制的过程，提高实验的可重复性 病毒的定量并非所有的病毒颗粒都有感染活性有感染活性的病毒颗粒一般仅占总数的几 百到几万分之一 病毒的定量 病毒的定量分为： 物理颗粒的数