【2017年整理】-5-6 PI法细胞周期检测.doc

细胞周期） 实验方法原理细胞周期（cell cycle)是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1、SG2期和M期组成。G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、SG2/M期。通过核酸染料PIDNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。 流式细胞仪的工作原理将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。PIDNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。 细胞周期示意图如（图一）所示 二、材料及准备工作 材料准备 试剂、耗材名称 品牌 货号 corning 6孔板 corning 10ml离心管 国产 1.5ml EP管 国产 胰酶（无EDTA） 贝博试剂盒中包括 RNase-A 贝博试剂盒中包括 PI 贝博试剂盒中包括 无水乙醇 国产 PBS 自配 2. 试剂配制PBS液体配方（0.1MPBS pH 7.4）以1L量为例： NaCl 80g Na2HPO4·12H2O 32.3g NaH2PO4·2H2O 4.5g（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.4，最后定容为1000mL。PBS 3.仪器设备 流式细胞仪细胞培养离心机水浴冰箱离心管封口膜移液器g左右离心5min，沉淀细胞。小心吸除上清，残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。 加入1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞， 800g×5min。为减少细胞损失可用1.5ml离心。 再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，残留约20ul左右的PBS，以 避免吸走细胞。重复第5步操作，用预冷的PBS再次洗细胞，并离心收集细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团，用250ul预冷的PBS重悬细胞。 2. 细胞固定： 缓慢加入750ul冰浴预冷无水乙醇，轻轻吹打混匀，4℃固定2小时或-20℃固定1小时，封口膜封口（此步可停止，-20℃保存样品，1周内样品检测不受影响）。 3. 染色： ①1000g左右离心3-5min，沉淀细胞。小心吸除上清，可以残留约50ul左右的70%乙醇，以避免吸走细胞。 ③加入约1ml冰浴预冷的PBS，洗涤细胞一次。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。 ④用200ul预冷的PBS重悬细 ⑤加入Rnase A溶液20ul，37℃水浴30min。 ⑥ 每管细胞样品中加入400ul碘化丙啶染色液，缓慢并充分混匀后4℃避光孵育30 min。染色完成后宜在24h内完成流式检测。 ⑦. 流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。 注意事项 1.RNaseA用PBS配制，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。 2.流式分析时需要的是单个细胞悬液，因此在操作过程中充分混悬细胞。 3.固定过程中不直接加7%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。4℃避光保存FlowJo分析细胞周期数据的过程 1.把细胞周期样品拖入FlowJo软件，双击打开原始数据。如(图二)所示： (图二) X轴选择FSC,Y轴选择SSC。分析细胞周期的细胞选择上图所示的细胞群体进行分析。 2. 在SSC/FSC图中双击分析的细胞群体，如（图三）所示： （图三） X轴选择FL3-LIN,用来表示PI的线性信号。Y轴选择FL3-PEAK,用来表示PI的峰值信号。本实