【2017年整理】八、检测口蹄疫病毒抗原的方法.doc

八、检测口蹄疫病毒抗原的方法 （一）口蹄疫反向被动红细胞凝集试验（反向被动血凝） 红细胞膜具有吸附抗原或抗体的特性，将提纯的口蹄疫抗体（IgG）在pH4.0醋酸缓冲液中致敏绵羊红细胞，当这种被致敏的红细胞（即红细胞表面均带有口蹄疫抗体），遇到相应的口蹄疫病毒抗原时，便产生抗原抗体的特异性反应，从而使红细胞发生肉眼可见的凝集现象。该法快速、简便、准确、可同步鉴定出口蹄疫毒型和鉴别口蹄疫、猪水泡病病原。 1．试验材料 V型96孔130o血凝滴定板、玻璃吸管（1毫升、5毫升规格）、玻璃中试管（内径15毫米，长度100毫米）、试管架、微量振荡器、微量移液器、塑料咀、玻璃板（与血凝板大小一致）、口蹄疫O、A、C、Asia-I 型、SVD（猪水泡病）反向被动血凝诊断试剂及其配套用的口蹄疫各型、猪水泡病阳性抗原、阴性抗原、稀释液、待检抗原。 ２．试验方法 　（１）稀释待检抗原 取中试管8支，横列于试管架上，每管各加入稀释液1 毫升，取待检抗原1毫升加入第1管混匀后从中取出1毫升加入第2管，混匀后取1毫升加入第3管……直至第8管，此时待检抗原的稀释度依次为1：6、1：12、1：24、1：48、1：96、1：192、1：384、1：768。 　（２）稀释阴性抗原　取中试管1支用记号笔标明“阴抗”字样，加入稀释液390微升，加入阴性抗原10微升，充分混匀，此时阴性抗原的稀释度为1：40。 　（３）稀释阳性抗原 取中试管20支，横列于管架标明“阳抗”字样，每排4支，（O型4支、A型4支、C型4支、Asia-1型4支、SVD4支）。每种阳抗第1管，加稀释液4.7毫升，第2~4管各加稀释液0.5毫升。取O型阳性抗原0.1毫升(100微升)加入第1排的第1管中混匀后取出0.5毫升，加入第1排的第2管并充分混匀，取出0.5毫升加入第1排的第3管混匀后取出0.5毫升加入第1排的第4管并混匀。 其他阳性抗原均按上法稀释，注意每稀释一种阳抗必须更换1支吸管，切勿混杂以免影响反应的特异性。经过上述稀释，各阳性抗原的稀释度依次为1：48、1：96、1：192和1：384。用于阳抗对照孔的只加第4管（1：384）的阳抗。 　（４）滴加待检抗原和对照抗原　取第8管稀释的待检抗原（1：768）加入血凝滴定板上的1~5排的第8孔，每孔50微升，取第7管待检抗原（1：384）加入1~5排的第7孔，取第6管待检抗原（1：192）加入1~5排的第6孔……直至第1孔，每孔均为50微升。1~5排的第10孔加入1：40的阴性抗原，每孔50微升。1-5排的第11孔依次加入O、A、C、 Asia-1型和SVD1：384稀释度的阳性抗原，每孔50微升（即第1排的第11孔加O型抗原；第2排的11孔加A型抗原；第3排的11孔加C型抗原；第4排的11孔加Asia –1型抗原；第5排的11孔加SVD抗原）。1-5排的第12孔各加稀释液50微升作为稀释 液对照。 　（５）滴加反向被动血凝诊断液 血凝板上的第1排1~8孔和10~12孔加O型诊断液，每孔25微升。第2排1~8孔和10~12孔加入A型诊断液，每孔25微升。第3排1~8孔和10~12孔加入C型诊断液，每孔25微升。第4排1~8孔和10~12孔加入Asia-1型诊断液，每孔25微升。第5排1~8孔和10~12孔加入SVD诊断液，每孔25微升。 　（６）振荡血凝板　加毕诊断液后，立即将血凝板置于微量振荡器上，中速振荡30秒，取下血凝板放在白纸上观察各孔的红细胞是否均匀悬浮，孔底应无红细胞沉淀，若全部或部分孔底尚有红细胞沉积，应继续在振荡器上振荡，直至充分混匀为止。 　（７）室温下静置 将混匀的血凝板，盖上玻璃板后静置2小时，判定检测结果，若对照孔红细胞沉降不清晰或因故来不及判定，也可静置第2天判定。 判定标准 先观察血凝板上1~5排的10~12孔，每排的第10孔为阴性抗原对照孔，应无凝集现象，红细胞应全部沉入孔底，形成边缘整齐的小圆点；每排的11孔为阳性抗原对照孔，应出现“++” ~“#”的凝集现象（即有50~100%红细胞发生凝集，红细胞悬于孔中，不沉入孔底），证明所加的反向诊断液效价不低于1：384，用于检测抗原合格；每排的第12孔为稀释液对照孔，也应无凝集现象，红细胞应全部沉入孔底，形成小圆点。 在上述对照孔判定合格的前提下，仔细观察血凝板上的1~5排的1~8孔，某排1~8孔或1~6孔均有“++” ~“#”凝集现象，而其余4排仅在1~2孔出现“+” ~ “++”的凝集，即可判定该份待检抗原为阳性。其型别与所加的反向诊断液的型别相同。比如第1排1~8孔出现“++”以上的红细胞凝集，第2~5排无此现象，便可判定该待检抗原为O型口蹄疫。 以出现“++”以上凝集的待检抗原最大稀释度为其抗原滴度。例如第1排的1~4孔出