【2017年整理】当归补血汤煮出汁激活成熟T淋巴细胞胞外信号控制激酶的研究.docVIP

当归补血汤煮出汁激活成熟T淋巴细胞胞外信号控制激酶的研究 摘要: 当归补血汤（DBT）源自紫云英类和当归类植物根部。这种中药煮出物已经被证实能够刺激T淋巴细胞增殖。然而这种激活的机理尚不得而知。在成熟T淋巴细胞中，当归多糖的应用能够显著诱导细胞的增殖，白细胞介素2，4，6的释放以及胞外信号控制激酶（ERK）的磷酸化。对ERK抑制剂的预处理阻止了DBT诱导免疫反应。另外，DBT的多糖富集片段对成熟T淋巴细胞具有显著作用，这表明DBT多糖在控制免疫反应中扮演了重要角色。 关键词 当归补血汤，紫云英属植物根部，当归类植物根部，T淋巴细胞，细胞原浆移动，ERK. 1 介绍 在数以千计的中国传统中草药中当归仅由两种草药构成。公元1247年中国人李东玉在其著作《内外伤编获论》中第一次记载了当归补血汤。李认为当归补血汤应该包括以下内容：10钱紫云英根，2钱当归。一钱大约相当于3克。在传统中医里，当归补血汤是用来治疗女性更年期综合症的。患者遵医嘱服下当归补血汤（DBT）来提升她们的“气”（生命活力）并促进血液循环。紫云英根作药用已经证实具有增强免疫力，保肝，抗糖尿病，阵痛，祛痰等作用。此外，当归因其能够促进血液循环常用来调节月经不调和改善机体免疫。虽然对这两种草药单一的生化分析早已进行了， 但对DBT中两种草药复合作用机理尚未研究，这无疑阻碍了复合中草药发展成为抗击疾病和机体功能失调有效手段的进程。 通过确定DBT中的生化组成，我们得以确定一个最优提取比例，有趣的是，这个比列与古代配方的比例RA：RAS=5：1是一致的。另外，在弄清了DBT中RA类衍生物：毛蕊，芒柄花素，RAS类衍生物：阿魏酸，藁本内酯的数量后，我们得以建立DBT的标准。 DBT的免疫管理（“气”功能中的一种）是由这里决定的。之前的研究显示DBT的使用能够刺激T淋巴细胞的扩散，然而对这种刺激起作用的分子尚不得而知。为了揭示这种古老草药煮出汁的作用机理，我们用DBT处理成熟的T淋巴细胞，之后分析了包括白细胞介素IL-2，4，5，6，8，10，13，巨噬细胞群落刺激因子（GM-CSF），伽马干扰素，肿瘤坏死阿尔法因子以及胞外信号控制激酶等10中细胞因子。此外我们还鉴定了DBT多糖的作用以及DBT诱导细胞因子释放的信号通路。 2 材料与方法 2.1 DBT的制备与标准化 我们于2002年收集来自中国陕西省的3年生黄芪植物根部和来自甘肃省的2年生的冬虫夏草根部。将RAS和RA以5：1的比例加入并在涡流中混匀而得到DBT。将混合物与8升水共煮两小时并提取两次。提取的方法遵照古代配方进行，此配方已被证实是最优提取方法。RA与RAS的分离样本也采用同样的提取方法。用70%乙醇处理DBT提取物沉淀可以将DBT多糖分割成富多糖片段和贫多糖片段两部分。在4000个g的离心加速度下离心20min即可将这两种片段分离开来。富集多糖片段占总干重的18%。将这两种片段用冻干法干燥并在-80摄氏度下保存。 DBT的标准化通过使用高效液相色谱法（HPLC）分析阿魏酸，毛蕊，芒柄花素以及藁本内酯的含量来完成。分析纯级试剂和HPLC级试剂来自德国达姆施塔特地区（Darmstadt）默克公司（Merck）。一套沃特斯（Waters）HPLC系统包括600台泵，717个自动采样器（auto-sampler），1台紫外可见光电二极管（UV/VIS Photodiode），以及用于全程分析的2996个检测器。色谱分离是用乙腈作为溶剂A以及0.01%磷酸作为溶剂B在DELTA-PAKC柱（粒径为4.7微米，3.9mmx150mm）内并在流速为1.0ml/min的流动相以及室温下进行的。 2.2 T淋巴细胞的成熟与增殖试验 人类T淋巴细胞来自Ficou-Hypaque捐赠的新鲜健康血液细胞。纯化的t淋巴细胞在RPIM-1640的环境下经过两次清洗再投入密度为100000个每格共有96格的成熟盘。其中有六成的t淋巴细胞是为了做XTT 试验的标准曲线而进行培养的。成熟的t淋巴细胞分别用DBT,RA,RAS,RA与RAS的混合物以及植物凝血素（PHA）处理3天。用25微升注射器将混合的XTT溶液注入每个方格中，在含空气95%和二氧化碳5%的饱和水溶液下经过四小时培养使其成熟。在450纳米条件下测量其吸光率。细胞数量由标准曲线决定。在阻碍试验分能够析中，MEK抑制剂U0126用二甲基亚砜溶解并于其他药物加入前3小时加入。用TPA作为ERK激活剂。 2.3 细胞素抗体试验与ELISA 成熟t淋巴细胞不同细胞分泌物的检测由镭射生物（Ray Biotech）完成。简要来说，抗体对对抗不同的细胞活素后会在人造的细胞活素试验器具上留下斑点。用DBT处理t淋巴细胞3天。在试验过程中持续加入100ul的条件培养液两小时以测量细胞活素的分