融合抗菌肽的抗菌活性及對猪淋巴细胞免疫活性的调节研究.docVIP

融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2的抗菌活性及对猪淋巴细胞免疫活性的调节研究 贾倩倩#, 万小平#,杨肖, 李飞林, 高荣* （四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610064） 摘要MAPWA和PGBD-2MAPWA和PGBD-2MAPWA和PGBD-2MAPWA和PGBD-2MAPWA样品液，具有更好的免疫增强调节作用。融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2MAPWA和PGBD-2。关键词：抗菌肽抗菌肽是生物机体防御系统产生的对抗外界病原体感染的肽类活性物质，广泛存在于从原核生物到人类的生物体中[]。[2-4]，而其还能调节机体免疫及促进免疫功能的作用[5-6]，是目前公认的替代抗生素的优良制剂。 本实验MAPWA和PGBD-2探索其对细胞的免疫刺激作用，为进一步的动物提供参考。lake96@; 【作者简介】 贾倩倩（1986），女，山东省烟台市人，硕士研究生，研究方向：动物生长免疫调控。E-mail：jqq317487082@163.com 万小平（1987），男，四川省武胜县人，博士研究生，研究方向：动物免疫调控。E-mail：xiaopingwan125@ *【通讯作者】 高荣（1966），男，四川省西昌市人，博士生导师，研究方向：动物传染病和微生物学。E-mail：gaorong96@ 1 材料和试剂MAPWA和PGBD-2基因工程酵母菌发酵上清液及酵母细胞裂解物：成都市金芝源生物技术公司提供； 猪淋巴细胞：分离自长白猪抗凝血液； MTT：四甲基偶氮唑兰，Sigma公司提供； 1640 RPMI淋巴细胞培养基：Sigma公司生产； 2 实验方法 免疫细胞的分离按猪淋巴细胞分离液使用说明从新鲜采取的3 m前腔静脉抗凝血中分离免疫细胞，用RPMI1640培养液（含青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL和10%胎牛血清）悬浮。取10 μ细胞悬液计数，将细胞悬液稀释至5×106/m，置于细胞培养板。MAPWA和PGBD-2对免疫细胞的增殖刺激活性检测 将上面分离和收集到的长白猪血液单个核免疫细胞，以1640培养基调节细胞悬液浓度1×106cell/ml； 分别加入待检样品液融合抗菌肽MAPWA发酵上清液（P1-1）、融合抗菌肽MAPWA细胞裂解分子（P1-2）、融合抗菌肽PGBD-2发酵上清液（P2-1）和融合抗菌肽PGBD-2细胞裂解分子（P2-2）各25ul；免疫细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板。每板设对照孔（加100ul完全 1640培养液）。 3、置37℃，5%CO2孵育16、24、48和72小时，倒置显微镜下观察细胞生长状态。 4、培养16、24、48和72后，每孔分别加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在Bio-Rad3550酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各样品孔的吸光值。 5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的MTT、二甲基亚砜、培养液），每样品设4个重复孔。 2.3融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定 最小抑制浓度(MlC)的测定: 微量稀释法测定融合抗菌肽对大肠杆菌、鼠沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌进行最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentration，MBC)的测定。具体操作方法参照文献进行：把处于对数生长期OD600 约0.5-0.7(细菌计数约1x107CFU/ml)的指示菌用LB培养液稀释到OD600为0.05，分别接种到96孔细胞培养板上，每孔接种100ul。将融合抗菌肽用pH6.0的0.lmol/LpBS分别倍比稀释成0.25ug/ml、0.5ug/ml、1.0 ug/ml至128ug/ml；各取100ul分别加入培养孔中，混匀，每组重复3个孔，设只加LB培养液的孔为阴性对照，接种细菌而不加抗菌肽的LB培养液为阳性对照。置37℃培养箱孵育16h后取出，用紫外分光光度计测量培养液的OD600值，结果判断以无OD值变化的孔中抗菌肽的浓度(终浓度)即为最小抑菌浓度。再将MIC附近各管培养液点种到LB固体培养基上，37℃培养12h，无细菌生长的药物最小稀释浓度即为最小杀菌浓度(MBC)值。 2.4融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2对不同细菌的抗菌活性测定一琼脂糖弥散法 在直径为10cm的平皿内倒入琼脂(含1.2%琼脂糖，0.03%营养肉汤粉，pH值为6.0)层和终浓度为106CFU