栓菌产生漆酶实践报告剖析.docx

实践报告课题名称：栓菌利用木质纤维素产生漆酶；专业班级：生物工程151班；姓名指导老师：一、研究背景木质纤维素是一种在自然界普遍存在的一种物质，白腐菌可以利用木质纤维素产漆酶漆酶(EC1.10.3.2,?Laccase,?lac)是一种含铜的多酚氧化酶，它能以分子氧作为电子受体将多种环境污染物氧化而生成水，是“生态友善”酶。漆酶作用底物广泛、催化效率高，在生物制浆、食品工业、木材加工、生物合成、生物能源、生物检测和生物修复等领域应用广泛，如造纸木质素的处理、含酚工业废水的处理、有毒环境污染物(如多环芳烃、有机氯农药、多氯联苯和合成色素等)转化、杀虫剂和除草剂等农药的降解等(Rodgers?et?al,?2009;?Abdel-Hamid?et?al.,?2013)。因此，漆酶被誉为“蓝色酶服务绿色化学”。漆酶在植物、真菌、少数昆虫和细菌等物种中广泛存在。真菌，尤其是担子菌门中的白腐菌是主要的漆酶产生者，且白腐菌中普遍存在表达模式、酶性质差异显著的多个漆酶同工酶。已知的漆酶高产白腐菌主要来源于栓菌属(Trametes)、多孔菌属(Polyporus)、密孔菌属(Pycnoporus)、云芝属(Coriolus)、侧耳属(Pleurotus)、白腐菌属(Phlebia)和革耳属(Panus)等，其中栓菌属真菌的漆酶具有热稳定性高、氧化还原电位高等优势，且热稳定性酶还具有抵抗化学变性能力强、耐受强酸碱的能力强、酶反应速度快等优势，是重要的漆酶基因资源和特殊用途漆酶的潜在来源。白腐菌漆酶在次级阶段受诱导表达，发酵周期长，需要外源添加诱导物（酚类、乙醇、某些金属离子）会造成污染、增加成本，因此商业漆酶价格昂贵严重制约了漆酶的大规模使用。另一方面，因环境污染物的组成成分、存在环境的复杂性，对高温、酸碱、有机溶剂、重金属等特殊条件耐受力强的特殊性质漆酶需求十分迫切。核桃青皮含有碳、氮能作为白腐菌生长的营养基质，同时核桃青皮中含有的酚类物质能作为漆酶诱导物，因此，核桃青皮是理想的白腐菌产漆酶基质。核桃在云南大量规模化种植，目前，核桃果实采收后大量青皮成为垃圾堆放在田间、地头或沟边，会造成严重的环境污染。虽然目前有对核桃青皮化学成分的提取研究和抗菌、抗氧化活性研究，但尚未见资源化利用核桃青皮产漆酶的相关研究，本研究的开展具有积极意义。（本段由严老师提供理论）核桃皮木质纤维素（核桃皮含木质纤维素成分，含多酚成分），栓菌能利用核桃皮木质纤维素成分为原料，以多酚成分为诱导物，大量产生漆酶。栓菌可以分解木质纤维素并产生漆酶。漆酶可以分解核桃皮产生的酚类化学物质，使这样的化学物质对其他植物生长所造成的抑制影响可以相对减弱。木质纤维素在自然界普遍存在，且其中的木质素难以降解，造成环境污染。而木质纤维素可以被栓菌分解，并产生漆酶。同时可以得到葡萄糖。众所周知，通过一系列的化学方法，葡萄糖可以聚合成很多东西，同时葡萄糖也是重要的能源之一，可以解决现在所存在的粮食问题。而且同时分解了自然界的污染物，可谓是一举多得。而分解后产生的漆酶，可以分解核桃皮产生的酚类有机物。一般在核桃树的周围，不会有植株生长，其原因就是核桃皮落在地上后，产生的酚类有机物融在土壤水分里，使其他植株不可以正常生长。二、研究材料和方法【以上四种实验，外加老师的拓展实验（总RNA的提取）】1.培养基的配置LB培养基: 用于培养细菌 GYP培养基：用于菌种活化及培养①LB培养基（固体）配方每100mL：1.蛋白胨 1g 2.酵母膏0.5g 3.NaCl 1g 4.琼脂 1.5g步骤1.按照每个培养基的量约为20-30mL，根据所需培养基的个数，配置对应量的培养基（以20个平板，每个平板为25mL为例）2.计算所需培养基总量为20x25mL=500mL。3.所需蛋白胨为5g，酵母膏2.5g，NaCl 5g，琼脂1.5g。准备一个500mL的烧杯，一个500mL的量筒，两个500mL的锥形瓶，洗净。4.在烧杯中加入约300mL的去离子水，加入上述量的蛋白胨，酵母膏和NaCl，不要加琼脂。5.在烧杯中加入转子，用磁力搅拌机搅拌2分钟左右，将混合好的液体倒入量筒中，向量筒里加入去离子水，至500mL处，再将溶液倒回烧杯中，继续搅拌2-3分钟。6.将搅拌好的溶液倒入量筒，进行分装。两个锥形瓶每个瓶子250mL的溶液（每个锥形瓶中的溶液不宜超过瓶体积的一半）。7.将琼脂各0.75g加入锥形瓶中（不要摇晃锥形瓶），将瓶口用棉布封住，系紧。8.放入高温灭菌锅里灭菌（可以同时处理平板）9.将灭菌后的溶液带去超净台操作，在溶液为50摄氏度左右时，进行倒平板。待溶液凝固，培养基制作完成。2.栓菌利用核桃皮产漆酶利用核桃皮为基质，接种栓菌，一