酶促反應动力学笔记.docVIP

酶促反应动力学 目的：酶催化反应的速度及各种因素对反应速度的影响 1.米氏方程的推导 米氏学说是1913年Michaelis和Menton建立的，认为反应分为两步，先生成酶-底物复合物（中间产物），再分解形成产物，释放出游离酶。经过Briggs和Haldane的补充与发展，得到了现在的米氏方程。 Ｓ＋Ｅ＝ＳＥ＝Ｐ＋Ｅ 对于上面的反应，首先有三点假设：第一，底物大过量，即[S]》[E]。第二，在反应初期，产物浓度极小，忽略逆反应即k-2=0；第三，稳态假设，即随着反应的进行，复合物的形成速度逐渐降低，分解加快，在某一时刻达到平衡，复合物的浓度为常数，这种状态称为“稳态”。体系达到稳态后，底物的消耗和产物的生成速度都是常数，且相等。经测定，酶加入体系后，在几毫秒之内即可达到稳态，所以我们测定的初速度通常是稳态速度。在产物积累较多之前，体系一直保持稳态，所以反应速度 v=k2[ES]。根据稳态假设，有k1[E][S]=(k-1+k2)[ES]，即[ES]=k1[E][S]/(k-1+k2)。定义(k-1+k2)/k1=Km，因为[E]= [E]0-[ES]，故[ES]= [E]0[S]/(Km+[S])。代入速度方程，得到v= k2[E]0[S]/(Km+[S])。因为当[ES]=[E]0时速度最大，所以Vm=k2[E]0。代入，得到下列米氏方程： v=Vm×[S]/(Km+[S]) 2.米氏常数的意义 米氏常数的物理意义是反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。其酶学意义在于，它是酶的特征常数，只与酶的性质有关，与酶浓度无关。不同的酶其Km不同，同种酶对不同底物也不同。在k2极小时1/Km可近似表示酶与底物的亲和力，1/Km越大，亲和力越大。在酶的多种底物中，Km最小的底物叫做该酶的天然底物。 3.米氏常数的测定 从酶的v-[s]图上可以得到Vm，再从1/2Vm处读出[s]，即为Km。但实际上只能无限接近Vm，却无法达到。为得到准确的米氏常数，可以把米氏方程加以变形，使它相当于线性方程，通过作图得到准确的米氏常数。 双倒数作图法 将方程改写为 1/v=Km/Vm×1/[S]+1/Vm 实验时在不同的底物浓度测定初速度，以1/v对1/[S]作图，直线外推与横轴相交，横轴截踞为-1/Km，纵轴截踞为1/Vm。此法称为Lineweaver-Burk作图法，应用最广，但实验点常集中在左端，作图不易准确。 Eadie-Hofstee法 将方程改写为v=-Km×v/[S]+Vm以v对v/[S]作图，直线斜率为-Km。 2、米氏常数的求法： ①双倒数作图法 Lineweaver Burk方程： 1 /V = Km/Vmax (1/[S]) +1/ Vmax，横轴的截距为-1/ Km； ②Hanes作图法/V = 1/Vmax [S] + Km / Vmax，横轴上的截距为-Km； 1/ Km近似地表示酶对底物亲和力的大小，1/ Km愈大，表示酶对该底物的亲和力愈大，酶促反应易于进行。 影响反应速度的因素 （一）pH的影响 大部分酶的活力受pH值的影响，在一定的pH值活力最高，称最适pH。一般酶的最适pH在6－8，少数酶需偏酸或碱性条件。如胃蛋白酶最适pH在1.5，而肝精氨酸酶在9.7。 pH影响酶的构象，也影响与催化有关基团的解离状况及底物分子的解离状态。最适pH有时因底物种类、浓度及缓冲溶液成分不同而变化，不是完全不变的。 大部分酶的pH-酶活曲线是钟形曲线，但也有少数酶只有钟形的一半，甚至是直线。如木瓜蛋白酶底物的电荷变化对催化没有影响，在pH4-10之间是一条直线。 （二）温度的影响 酶活随温度变化的曲线是钟形曲线，有一个最高点，即最适温度。温血动物的酶最适温度是35－40度，植物酶在40－50度。这是温度升高时化学反应加速（每升温10℃反应速度加快1－2倍）与酶失活综合平衡的结果。一般酶在60度以上变性，少数酶可耐高温，如牛胰核糖核酸酶加热到100度仍不失活。干燥的酶耐受高温，而液态酶失活快。 最适温度也不是固定值，它受反应时间影响，酶可在短时间内耐受较高温度，时间延长则最适温度降低。 热失活的活化能一般为50-100Kcal/mol，比一般反应的活化能高10倍，在30℃以下是稳定的。 激活剂的影响 凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂。大部分激活剂是离子或简单有机化合物。 抑制剂（inhibitor）的作用 使酶活力下降，但不引起酶蛋白变性的作用称为抑制作用。能引起抑制作用的物质叫做酶的抑制剂。抑制剂与酶分子上的某些必需基团反应，引起酶活力下降，甚至丧失，但并不使酶变性。研究抑制作用有助于对酶的作用机理、生物代谢途径、药物作用机制的了解。 不可逆抑制(irreversi