探讨APC基因启动子区甲基化状态及其在宫颈癌发生发展中的意义.docVIP

探讨APC基因启动子区甲基化状态及其在宫颈癌发生发展中的意义 　　摘要：目的 研究与分析腺瘤性结肠息肉病基因启动子区甲基化表现状态及其在宫颈癌中发生及发展的作用及意义。方法 选取本院所收治的120例宫颈鳞癌患者及30例正常宫颈上皮组织进行研究，并采用甲基化特异性聚合酶链反应法检测其组织中腺瘤性结肠息肉病基因启动子区甲基化状态，分析并比较。结果 经检测发现，30例正常宫颈上皮组织中未检测到腺瘤性结肠息肉病基因甲基化片段，而宫颈癌组织中，其腺瘤性结肠息肉病基因甲基化阳性率为65.0%（78/120）；两组阳性率比较（P0.05）。结论 宫颈癌形成过程中，腺瘤性结肠息肉病基因启动子区异常甲基化是早期且较为频繁发生的事件，因此，其可能参与到宫颈癌的发生与发展中，进而为临床疾病诊断及预后判断提供重要的参考价值。 　　关键词：腺瘤性结肠息肉病；宫颈癌；基因；甲基化 　　腺瘤性结肠息肉病（Adenomatous polyposis coli；APC）基因是人体中一种重要抑癌基因[1]。经相关研究发现[2]，腺瘤性结肠息肉病基因启动子区甲基化变化与多种恶性肿瘤存在紧密联系。然其甲基化变化与宫颈癌间的相关性研究报道较少[3]。本次研究采用甲基化特异性聚合酶链反应法检测宫颈癌及正常宫颈组织中腺瘤性结肠息肉病基因启动子区甲基化状态情况，以探讨与分析腺瘤性结肠息肉病基因与宫颈癌发生及发展的相关性，为临床诊断及预防宫颈癌提供重要参考依据，报道如下。 　　1 资料与方法 　　1.1一般资料 选取贵阳市妇幼保健院妇科2011年6月～2014年10月所收治的120例宫颈鳞癌患者及30例正常宫颈上皮组织进行研究，本次研究标本均为手术切除或门诊活检所得新鲜标本。且所有组织均经病理学检查证实，研究方案经医院伦理委员会批准，患者自愿参与研究且签署知情同意书。术前未采用任何方式对患者进行治疗，患者术后资料完整，精神正常，可配合进行研究。宫颈癌组织中，年龄27～68岁，平均为（46.5±1.0）岁；临床分期：I期54例、II期48例、III期+IV期18例；组织学分级：G1～G2为78例、G3为42例；病理类型均为宫颈鳞状上皮细胞癌，淋巴结转移者为26例、无淋巴结转移者为94例。正常宫颈上皮组织中，年龄22～65岁，平均为（44.0±1.0）岁。 　　1.2方法 本次研究的新鲜组织在离体后立即放入液氮速冻，并转入到-70℃冰箱中保存备用。试剂：酚、Proteinase K（Merck）、Taq DNA聚合酶、氯仿（Sigma）、dNTP、W izard DNA纯化试剂盒（Genmed）、引物合成（上海生工）[4]。基因序列：APC甲基化：5-TATTGCGGAGTGCGGGTC-3、5-TCGACGAACTCCCGACGA-3；长度为98bp。APC非甲基化：5-GTGTTTTATTGTGGAGTGTGGGTT-3、5-CCAATCAACAAACTCCCAACAA-3；长度为108bp。DNA提取：选取新鲜组织100mg于液氮中碾碎，并采用蛋白酶K消化和苯酚-氯仿法进行抽取，同时采用乙醇沉淀法提取组织中DNA，最后采用TE缓冲液进行稀释、溶解，再采用紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度，并放置于-20℃冰箱中保存以备用[5]。DNA的亚硫酸氢盐修饰：取2ugDNA放置于EP管中，然后加入双蒸水进行稀释到50ul，并加入5.5ul新鲜配制的3.0mmol/L氢氧化钠溶液，并摇匀，放置于37℃水浴中恒温12min，再加入10mmol/L对苯二酚30ul、3.6mol/L亚硫酸钠520ul，避光并混匀，待混匀后通过纯化柱。使用W izard DNA纯化回收系统提纯DNA，加5.5ul新鲜配制的3mmol/L氢氧化钠溶液，于37℃水浴中恒温12min，再加入5mmol/L醋酸铵41ul，再使用无水乙醇沉淀DNA，并加入20ul双蒸水进行溶解，并放置于-20℃冰箱中保存以备用。MSP反应：PCR反应体系（25ul）：10×PCR buffer 25.0ul 2.5mmol/LdNTP混合物4.0ulMgCL2、4.0ulTaq酶0.2ul。引物分别为1ul，模板DNA2ul；去离子水补齐到25ul。反应条件：95℃环境下预变性9min，95℃变性30s，退火[APC（M）：55℃、APC（U）：62℃]1min，72℃延伸30s，循环37次。72℃延伸5min，产物4℃保存。取10ul PCR反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，并采用凝胶成像分析仪来采集图像。 　　1.3结果判断 甲基化引物扩增出现条带，则判定为甲基化阳性；非甲基化引物扩增出现条带，而甲基化未扩增出条带，则判定为甲基化阴性。甲基化与非甲基化引物均扩增出现条带，则判定为部分甲基化。 　　1.4