1046大腸杆菌检查法标准操作程序.docVIP

1 目的：规范大肠杆菌检查操作，保证检验结果准确。 2 范围：本程序适用于药品大肠杆菌的检查。 3 责任者：QC员、QC复核人员、QC主任。 4 程序： 4.1试药与试液 除特别注明外，试验中所用的试剂均为分析纯试剂，水为纯化水。 4.1.1 0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠[NaCl]9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟。 4.1.2 无菌磷酸盐缓冲溶液(pH7.2) 取磷酸氢二钠[Na2HPO4·12H2O]25.8g和磷酸二氢钠[NaH2PO4·H2O]4.4g，加水使溶解至1000ml，121℃灭菌20分钟。 4.1.3 α－萘酚乙醇试液 取α－萘酚6.0g，加无水乙醇溶解使成100ml。 4.1.4 40％氢氧化钾试液 取氢氧化钾40g，加水溶解使成100ml。 4.1.5 靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛[C9H11NO]1g，加入95%乙醇[C2H5OH]95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸[HCl]20ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，置冰箱保存，备用。 4.1.6 甲基红试液 取甲基红[C15H15N3O2]0.1g，加95%乙醇[C2H5OH]300ml与水适量，使溶解，再加水至500ml，即得。 4.1.7 V-P试液 取α-萘酚[C10H7OH]6.0g，加无水乙醇[C2H5OH]使溶解成100ml。另取氢氧化钾40.0g，加水使溶解成100ml。分别将试药与各溶剂混合即得。 4.1.8 革兰染色液 4.1.8.1 沙黄染液 取沙黄0.25g，加95%的乙醇[C2H5OH]10ml，使完全溶解后，加水至100ml。4.1.8.2 结晶紫染液 取结晶紫[C25H30ClN3]1.0g，加95%的乙醇[C2H5OH]20ml，使溶解，加1%的草酸铵溶液80ml，混匀。静置48小时使用，置密闭棕色瓶中储存。 4.1.8.3 碘试液 取碘化钾[KI]2.0g，加水3?5ml使溶解，加入碘片[I2]1.0g，使全部溶解后，加水稀释至300ml，置密闭棕色瓶中储存。 4.1.8.4 95％乙醇。 4.1.9 溴麝香草酚蓝指示液 4.2 培养基的种类 4.2.1 营养肉汤培养基 4.2.2 营养琼脂培养基 4.2.3 胆盐乳糖培养基（BL） 4.2.4 4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG) 4.2.5 乳糖培养基 4.2.6 5%乳糖培养基 4.2.7 蛋白胨水培养基 4.2.8 磷酸盐葡萄糖胨水培养基 4.2.9 枸橼酸盐培养基 4.2.10 曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB） 4.3对照用菌液 取大肠杆菌[CMCC (B) 44102]的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，36?1℃培养18?24小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1:106，使对照菌液加入量含菌50?100个（一般用量为0.1m1），其菌数在做阳性对照的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。 4.4仪器与设备 4.4.1 菌检室。 4.4.2 净化工作台，恒温培养箱（36±1℃），微波炉，恒温水浴（45?1℃），高压蒸汽灭菌器，电冰箱，匀浆仪，离心机（500?4000转/分钟），显微镜（1500倍），紫外灯（366nm）。 4.4.3 薄膜过滤装置：微孔滤膜直径约50mm，孔径0.45?0.02?m。 8.4 锥形瓶（250?300ml，内装玻璃珠若干），研钵（陶瓷制，直径l0?12cm）、培养皿（9cm），量筒（100ml），试管（18?180mm）及塞，吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1），注射器（20ml或30ml），注射针头，载玻片，盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。 4.4.4 玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于160℃干热灭菌2小时或高压蒸汽121℃灭菌30分钟，烘干备用。 4.4.5 大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70?75%乙醇溶液浸泡）。 4.4.6 无菌衣、帽、口罩、手套。洗净后配套，用牛皮纸包严，灭菌，备用。 4.4.7 接种环（白铱金或镍铬合金，环径4?5mm、长度6?10cm），乙醇灯，乙醇棉球或碘伏棉球，灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子，灭菌钢锥，灭菌称样纸，不锈钢药匙，试管架，火柴，记号笔，白瓷盘，洗手盆，陶瓦盖（12cm）等。 所有进入无菌室的物品必须经过消毒或灭菌，应严格按照《菌检室物品进出标准操作程序》（SOP Q