基因工程PCR课件[精选].pptVIP

技术关键： 两个引物的浓度相差100倍。 低浓度的引物（限制引物）首先耗尽，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA，最后产物中99%是单链DNA。可用于Sanger法测序。 （2）不对称PCR 用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。 技术关键： 利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。 （3）反转录PCR（RT-PCR) 扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。 Temin,H.发现反转录酶， 1975诺贝尔奖 * * 第五章 聚合酶链式反应（PCR） 基因扩增（gene amplification) 1. 环境诱发扩增 在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。 2. 基因的程序性扩增 在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基因的扩增。 3. 基因组进化扩增 生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。 4. 基因工程扩增 载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。 5. PCR扩增 应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。 5.1 （1）1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。 由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。 （2）1985年Cetus公司的科学家K.B. Mullis发明了PCR，使这一设想变成现实 PCR的发明 Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。 （3）Taq DNA 聚合酶 1986年H.A. Erilish从嗜热水生菌分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替Klenow片段，PCR技术才进入实用阶段。 1988年R.K. Saiki 把Taq DNA聚合酶用到PCR反应中，使PCR自动循环仪成为可能。 （4）PCR 仪 1988年Cetus公司发明自动热循环仪。 5.2 PCR扩增原理 PCR ? 是在模板DNA、引物和dNTPS存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。其扩增原理是以半保留复制的形式进行，在体外进行DNA的变性、退火和引物延伸三个阶段的循环反应。 Polymerase Chain Reaction (PCR) 根据已知的DNA核苷酸序列从两个5’-端合成两条16~24bp的引物 要进行PCR反应，必须对目的基因片段两侧的序列了解清楚，至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。就可通过PCR反应，直接从染色体DNA或cDNA上高效快速地扩增出目的基因片段。 5.3 PCR技术特点 pg、ng 的DNA模板分子即可。 （1）特异性强 错配率约万分之一（2×104）。扩增产物的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。 （2）敏感性高 （4）简便 扩增产物直接作序列分析和分子克隆，不必按常规方法先克隆再做序列分析。 （3）快速 整个PCR过程约4hr完成。样品处理约1hr ， PCR 2hr，产物凝胶电泳分析约1hr。 Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出A碱基末端的双链DNA分子，根据这一发现设计了克隆PCR产物的T-载体。 利用Taq polymerase的特性 利用restriction enzyme （5）可扩增RNA or cDNA 有些外显子分散在一段很长的DNA中，难于将整段DNA大分子扩增和做序列分析。若以mRNA作为模板，可将外显子集中，用PCR一次完成对某些外显子的扩增并进行序列分析。 RT-PCR： 先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。 模板可以是cDNA的第一条链，也可以是总DNA。 对大批量PCR产物分析不影响，但用于克隆的DNA，必须检测克隆产物的DNA序列。 （6）对材料（模板）质量要求低 微量、粗制及部分降解的DNA材料都可作为起始材料。 （7）有一定程度单核苷酸错误掺入 5.4 PCR反应体系 1. Taq DNA聚合酶 ① 热稳定性 Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。 ② 最适温度高 最适温度： 75 ~ 80 ℃ 延伸速度：35~150 nt/(s·酶分子) 最长延伸长度：6.7kb ③ Taq 酶的缺点 具有5’-3’聚合酶活性和5’-3’外切酶活性，但没有3’-5’外切酶活性，因此不能修正错误的碱基配对！ 合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。 其它耐热的DNA聚合酶 ① Tth DNA聚合酶 无3’ → 5’DNA