大肠杆菌感受态细胞的制备、[精选].ppt

转化方法的实验原理 热激法是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～107转化子/μg DNA。 电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/μg DNA。 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 　　 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 　　 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比 加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。 1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 　　 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 　　 4. 防止杂菌和杂DNA的污染： 整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 思考题 　　1. 制备感受态细胞的原理是什么？ 　　2. 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？ * * 大肠杆菌感受态细胞的制备、 重组DNA的转化、克隆筛选 1. 实验目的和要求 通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。 了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 2. 相关知识及原理 感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的细胞 。 （人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因 ） 转化（transformation）： 是将异源DNA分子导入受体细胞，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 转化的方法： 化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞； 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 3．仪器、材料和试剂 无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机，移液器，微型离心管等； 菌株：E.coli jM109 质粒：pUC+DNA 片段的重组质粒 LB培养基； 含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素，终浓度100μg／mL ) 氨苄青霉素；母液200mg/ml 预冷CaCl2溶液（0.1mol／L） 4．操作步骤 1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法) （1）从新活化的E.coli E.coli jM109菌平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右,将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养； （2）每组取培养液1-4ml转入离心管中，在冰上冷却5min(可省略）,5000r／min离心2min （3）倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴30min ； （4） 5000r／min离心2min； （5）弃去上清液，加入400μl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。 5000r／min离心2min ； （6）弃去上清液，加入200μl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； （7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘