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RT-PCR技术 RT-PCR简介 RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。） 　　RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。 实时PCR 　　实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。 　　real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是在ds DNA（双链DNA）反转录PCR相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）” RT-PCR技术相关试剂 　oligo: 多聚体，相当于mRNA引物 　　AMV（M-MLV）：逆转录酶 　　dNTP：脱氧核苷酸 　　RNase：RNA酶抑制剂 　　PCR Buffer：RT-PCR缓冲液 　　MgCl2：2价镁离子 PCR各步骤的目的 （一）预变性： 　　破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。 使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。 （二）变性--退火--延伸循环： 　　①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为 反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 （三）PCR仪扩增循环后72度延伸10分钟 　　用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因： 　　1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用taqDNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。 　　2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。 3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。 RT-PCR的注意事项 在做Northern等杂交实验、构建Cdna互补DNA文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、获得RNA病毒基因时，会用到RNA提取和RT-PCR技术。真核生物的基因组是DNA，为什么不直接从DNA PCR得到我们需要的基因呢？因为真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内元（intron），真正编码蛋白的区段是被这些内元隔开的，这些编码区叫做外元（exon）。真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻译成蛋白质。 所以，如果直接从真核生物的基因组DNA获取目的基因，克隆再表达，试图获取目的蛋白的思路是行不通的，因为获取的DNA里面会含有非编码区。要表达真核生物的基因并表达出相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条颇费周折的途径。 1．RNA的提取RNA的提取其实原理很简单：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。 1．1 分离高质量RNA成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。 一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA