【2017年整理】异种动物ig免疫白兔实验设计.docxVIP

异种动物ig免疫白兔实验设计1. 器材：剪刀（剪兔毛用）一把、弯头眼科手术镊子（游离血管用）一把、直头眼科手术剪（剪血管用）一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿（直径18cm）、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。2. 试剂：生理盐水(或PBS)，弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant, FCA） Sigma F-5881，弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant, FIA) Sigma F-5506，二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN33. 兔子的选择：兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。4. Pre-bleeding： 抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。取血量约5ml足矣。 免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。 免疫方法可采用背部多点注射法。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射（不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好）。每次免疫的抗原量约100μg。免疫次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。 免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。因为起初几次免疫产生的抗体的效价比较低，头两次取血，够检测用即可。在三次免疫后，可以获得较高效价的抗体，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否则会造成兔子贫血。最后一次取血可以采用颈动脉放血，具体操作如下：a.家兔仰卧于兔架上固定头部，用纱布固定四肢。头部略放低以暴露颈部。剃毛并消毒皮肤；b.沿颈部中线用手术刀切开皮肤约10cm，分离皮下结缔组织，直至暴露出气管两侧的胸锁 乳突肌（小心操作，如碰到小血管出血，可用止血钳止血）c.用直头止血钳分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后用弯头眼科镊使之游离，剥离神经和结缔组织；d.于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住；e.用小拇指垫在血管下，用尖头眼科手术剪在两根丝线间的动脉璧上剪一小口（勿剪断），插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱；f.松开止血钳，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。5. 血清的分离： 如果用三角瓶或平皿盛血，将器皿倾斜放置于37oC烘箱2hr，转移到4oC沉淀过夜，第二天早上用吸管吸取血清。如果用离心管收集，37oC烘箱放置2hr，转移到4oC沉淀过夜，第二天早上离心，10000RCF，10分钟。在血清中加入 NaN3 至终浓度0.02%，分装后-20oC保存。多克隆抗体制备（一）多克隆抗体制备原理1．多克隆抗体的概念多克隆抗体：在含有多种抗原决定簇的抗原刺激下，体内多个 B 细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的单克隆抗体，其混和物为多克隆抗体。机体内所产生多克隆免疫血清实质上是由多种抗体组成的混合物，又称多克隆抗体。2.多克隆抗体产生原理初次反应的抗体持续时间较短，亲和力也较低，多无实际应用价值。机体初次接触抗原后，激发体液免疫应答反应。在Moslash; 和Th 的作用下，B 细胞被激活,增生分化为浆细胞和记忆B 细胞（Bm）。浆细胞产生特异性抗体。由于初次反应时，只有少量对该抗原特异的免疫活性细胞被诱导而增生分化为浆细胞。随着抗原的消耗，抑制T 细胞（Tc）的激活和循环抗体的反馈抑制作用，浆细胞减少，抗体滴度很快下降。二次反应产生的抗体主要是高亲和力的IgG。机体再次受同一抗原刺激后，对该抗原特异性的Bm 迅速增殖分化为浆细胞，产生特异性抗体。Th 的记忆细胞也加快反应的进行，在抗原作用1~2 天后，抗体滴度迅速上升。抗体合成率为初次反应的几倍到几十倍。3. 多克隆抗体制备方法流程纯化的抗原→与弗氏佐剂一起充分乳化→注射动物体内（剂量，次数，途经等均要适宜）→测定效价（如效价高，则不必加强免疫） → 1 周后经动脉放血→分离血清→纯化抗血清备用。（二）材料与试剂1．提取的动物Ig2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂3．青霉素和链霉素4．实验动物 兔5．其它材料及试剂（三）操作方法1．免疫方法 可以采用以下各种方法之