【2017年整理】发酵工程实验讲义-411.docVIP

PAGE 8 实验三 微生物菌体量的测定 了解测定菌体量的原理，掌握质量法、比浊法和血球计数板法测定液体培养过程中菌体量的实验技术。 微生物菌体量的测定方法可分为基于细胞物理性质变化的直接法和基于细胞内（或外）成分变化换算而得出的间接法。 当微生物以单细胞（无凝聚性）形式生长时，培养基中悬浮粒子数的增加可作为生长菌体量；霉菌、放线菌等以菌丝体形式生长时，菌体量与悬浮粒子间无对应关系。另外，液体培养基中的不溶解成分会影响到菌体量的测定。固体培养中由于培养基颗粒的影响，更多的是采用间接法测定微生物菌体量。 质量法测定酵母菌生物量 实验材料 菌种：酿酒酵母No.30 种子活化培养基：麦芽汁斜面 液体培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，调整pH至5.5。 实验步骤 培养基灭菌：取250ml三角瓶12只，分别加入前面配好的液体培养基70ml，使用12层纱布封口后，于121℃高温灭菌15min，冷却备用。 种子活化和接种：将酿酒酵母No.30接入种子活化培养基，30℃培养24h后，取No.30斜面酵母菌2环，接入装有30ml生理盐水的三角瓶中，充分摇匀。取活化后的酵母种子分别接入已灭菌冷却的12只三角瓶培养基中，每瓶2ml。振荡混匀。 培养：将已接种的三角瓶培养液置于振荡培养箱，200r/min，30℃培养，每隔6h取样2瓶，共取样6次。取得的样品0~5℃冷藏待测。 测定： ①取6cm圆形定性滤纸6张，于80℃烘干至恒重，迅速准确称其质量并记录； ②将每次取得的两瓶样品混合以消除生长不平衡，取其中的100ml用上面称量好的滤纸过滤，并用蒸馏水洗涤滤出物2次； ③将滤纸连同滤出物于80℃烘干至恒重，迅速准确称其质量并记录，滤纸前后质量的差值即为菌体量。 数据处理 将测得数据填入下面表格： 表2-1 质量法测定菌体量 样品编号 1 2 3 4 5 6 滤纸原重/g 滤后重/g 菌体量g/100ml 作图：按测定菌体量的结果，作菌体量X对培养时间t的曲线，即酵母细胞生长曲线。 分析：分析酵母细胞生长曲线的规律，识别静止、对数、稳定、衰亡期等阶段。 浊度法测定酵母菌生物量 1、原理 当白色光通过光孔照射到菌体悬浮液时，会产生光散射和光的透射现象。当利用浊度计测定菌体悬浮液的浊度时，通过测定样品的透射光率和散射光率，可确定菌体悬浮液的相对浓度。 当光通过细胞悬浮液时，入射光的强度为I，透射光通过厚度为h的悬浮介质层后的强度为I0，根据Lambert-Bear经验式， I = I0 e-τh 式中τ——浊度，τ=ρτ 式中ρ——悬浮液中颗粒质量浓度（mg/ml） τ——浊度系数 当h=1cm时， 式中左边log(I0/I)为吸光度，其反映了液体浊度的变化。在普通光电光度计上把log(I0/I)换算为吸光度刻度标出。对于微生物培养液所测结果常称之为OD（optical density）值。 进行测定操作时，应事先针对被监测菌作出标准曲线。即使同一种菌，也会因菌的生理性质等的不同而改变干重与浊度之间的关系，但多数情况下还是相对稳定的。 选择测定波长要考虑培养基的颜色，肉汤等用红色滤光片，无色悬浮液用蓝色滤光片。 2、实验材料 721型分光光度计、血细胞计数板、显微镜； 100ml酿酒酵母菌悬液、无菌生理盐水、试管、无菌吸管。 实验步骤 3-1标准曲线的绘制 编号：取无菌试管7支，分别用记号笔将试管编号为1、2、3、4、5、6、7。 调整菌液浓度：用血细胞计数板计数培养24h的酿酒酵母菌悬液，并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升1×106、2×106、4×106、8×106、10×106、12×106含菌数的细胞悬液。再分别装入已编号的1—7号无菌试管中。 测OD值：将1—7号不同浓度的菌悬液摇匀后，置于560nm波长、1cm比色皿中测定OD值。比色测定时，用无菌生理盐水作空白对照，并将OD值填入表2-2。每管菌悬液在测定OD值时，均必须先摇匀后再倒入比色皿中测定。 表2-2 菌悬液测定OD值 管号 1 2 3 4 5 6 7 细胞数106/ml 光密度（OD） 以光密度（OD）值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。 3-2样品测定 将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇匀后，用560nm波长、1cm比色皿测定光密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。 各种操作条件必须与制作标准曲线时的相同，否则测得的值所换算的含菌数就不准确。 3-3根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数。 实验注意事项 4-1当原液的吸光度值小于0.3时，应离心浓缩细胞，然后按原液、原液×0.8、原液×0.6、原液×0.4、原液×0.2、原液×0.1，用缓冲液