E.Coli 感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、提取与酶切鉴定幻灯片.pptVIP

过42℃短时间的热激处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。 2、碱裂解法小量制备质粒DNA：碱裂解法是基于线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的的，在pH12.0～12.6的碱性环境中，线型染色体DNA和环型质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分离；当将pH值调节到中性并在高盐浓度下，已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子 RNA和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。 3、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、III型三大类，Ⅰ类和III类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，但却随机地切割回转到被结合 处的DNA。Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ限制酶在基因工程中基本不用，II类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点如下： (1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如EcoR I识别与切割序列为5`····GAATTC····3` 3`····CTTAAG····5` (2) 、识别的核苷酸数目大多数为4～6个，少数识别8～13个； (3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶产生的是具有凸出的粘性末端： 影响核酸限制性内切酶活性的因素： DNA的纯度； DNA的甲基化程度； 酶切消化反应的温度； DNA的分子结构；溶液中离子浓度及种类； 缓冲液的 pH值。 4、琼脂糖凝胶电泳: 琼脂糖溶化再凝固后能形成带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质 (密度与琼脂糖浓度相关)；而生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中磷酸基团呈离子化状态，因此将核酸分子置于电场中时，它们会向正极迁移，由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构象。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快。直接用低浓度的EB进行染 镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸水纸，一次性塑料手套等； E.coli DH5α受体菌(R-M-)， pGEX-PDIP-r质粒(AmpR) 2、试剂： LB培养基:蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L， NaCl 10g/L，琼脂粉 15g/L（固体培养基），用10 mol/L的NaOH调节pH为7.0，高压灭菌； 氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL； 含有抗菌素的LB平板培养基：将配置好的LB固体培养基高压灭菌后，冷却到60度左右，加入氨苄青霉素（终浓度为50μg／mL浓度50-100μg／mL）； 0.1mol/LCaCl2：称取1.1g进口无水CaCl2，溶于70mL双蒸水中，定容到100mL，过滤后灭菌； 0.1mol/LCaCl2 15％甘油：100ml 0.1mol/L CaCl2 溶液内含有15ml甘油，高压灭菌； 溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸，28.5mL