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有机溶液体系中DTGH催化对羟基苯乙醇糖苷化反应 有机溶液体系中DTGH催化对羟基苯乙醇糖苷化反应 食品科学与工程 张中冀摘要：本文研究了有机溶剂体系中葡萄糖苷酶催化合成芳烷基糖苷的逆水解反应。之前的研究表明在对羟基苯乙基β－D－葡萄糖苷的反应中，以pH 6.0, 70 mM的Na2HPO4－KH2PO4为缓冲液时反应初速度最高。缓冲溶液的种类对反应72 h的转化率几乎没有影响，有机溶剂的种类和含量是反应体系的关键参数， 二氧六环-缓冲溶液(90%, v/v)的体系中产率最高。并考察了酶在不同二氧六环含量下的失活情况，表明热力学平衡是限制反应产率的主要因素。增加对硝基苯甲醇的浓度可将合成反应的平衡转化率提高至13.5%。本实验的反应是用D－半乳糖代替β－D－葡萄糖进行反应，生成对羟基苯乙基β－D－半乳糖苷。以DTGH酶催化对羟基苯乙醇糖苷化为模型反应，在原有资料的基础上对反应温度、摇床转速、缓冲溶液与有机溶剂的种类和含量进行系统优化。 关键词：葡萄糖苷酶，半乳糖，水-有机溶剂单相体系，对羟基苯乙醇 1 研究背景 1.1生物体内的糖苷化合物 糖苷化合物是环状单糖上的半缩醛与R-OH、R2NH及R-SH等形成的一类缩醛类的化合物，特称糖苷(G1ycoside)。糖苷分子中糖的部分被称为糖基，非糖部分称为配基，连接糖基与配基的键称为苷键。根据苷键的不同，糖苷可分为含氧糖苷、含氮糖苷和含硫糖苷等几类，其中以含氧糖苷最为常见，通常未作特殊说明的糖苷化合物均指含氧糖苷。由α构型半缩醛羟基形成的糖苷称为α-糖苷；由β构型半缩醛羟基形成的糖苷称为β-糖苷。一般自然界中存在的糖苷多数是β-糖苷。 糖苷化合物广泛存在于生物体内，其中很多具有特殊的生物活性，担负着重要的生理功能[1]。植物的叶、籽粒和树皮中存在数目众多的糖苷，对植物的生长具有重要作用。动物体中也存在有糖苷，如脑和神经组织中的脑苷。 植物糖苷的功能是多方面的。许多糖苷具有很苦的味道，有的还具有毒性，能防止动物的侵食，对于植物的生命具有保护作用。树皮中常含苯酚糖苷，籽粒中常含有扁桃苷，这些糖苷经过糖苷酶的水解，能产生毒性物质苯酚或氢氰酸，籍此保护受伤部分，防止微生物的侵入。苯酚类糖苷可能还具有除去毒性物质(如苯酚等化合物)的功能。糖苷还具有储存糖的功能，特别是在籽粒中，储存的糖在生长的一定阶段随需要而释放[2]。许多高等植物的花朵和果实呈现的鲜红、绯红、紫、紫红以及蓝色等颜色大多数是由深色的植物色素——花色苷(Anchocyanin) [3] 所产生的。花色苷的主要功能是为植物的花果提供鲜艳的颜色，引诱昆虫和其它动物为其传授花粉、散播种子，存在于花色苷里的糖包括葡萄糖、乳糖、鼠李糖、木糖或阿拉伯糖等，从植物中提取的花色苷已广泛用于食品工业。 目前获得糖苷化合物的方法有三种：从生物体中提取，化学合成和酶促合成。生物体内所含的糖苷化合物含量很低，而且往往是混合糖苷，将那些含量很低的混合糖苷一个个分离纯化获得纯品，分离过程复杂，费时、费力又不经济，很难用于工业化生产。在化学合成烷基糖苷的方面，经典的费歇尔糖苷化得到的是两种构型异构体的混合物，且以?构型为主。最常用的Koenigs-Knorr方法则以等当量的重金属盐作为催化剂，尽管近几十年经过各种改进，但反应过程仍须进行糖羟基的保护与脱保护，不仅步骤繁琐，而且从环境和健康角度来看也有很大的不足之处。酶催化合成糖苷化合物反应条件温和、环境友好、选择性高并可直接以非保护的糖作底物，引起了人们的广泛关注。 1.2 糖苷酶催化合成糖苷的研究 糖苷化合物普遍存在于自然界尤其是植物中，芳香化合物的醇，酚和硫醇基本都其糖苷化合物存在。烷基葡萄糖苷是糖化学中有用的合成砌块，可作为非离子表面活性剂，还广泛应用于化妆品、制药以及食品行业。与化学合成反应相比，酶促反应以它的反应条件温和、环境友好、高选择性、以及可直接以未保护的糖作底物等优点引起了人们的广泛关注。两类酶在糖苷合成中被广泛研究，即糖基转移酶和糖苷水解酶。糖基转移酶有极佳的异头碳选择性和专一性，应用于复杂的大分子合成中，但糖基转移酶来源有限且分离困难，底物尿嘧啶二磷酸糖苷极其昂贵, 同时酶容易失活，且一般不接受非天然底物，这些缺点限制了糖基转移酶的应用。糖苷水解酶则相对易得，稳定，能接受各种不同的底物，异头碳选择性是绝对的。糖苷水解酶的生物功能是水解糖苷键，但这个过程可以在两种方式下逆转：转糖苷化(动力学控制)和逆水解(热力学控制)。转糖苷化是以活化的糖苷作为糖基给体，该过程与水解竞争，且产物会被二次水解，一般产率不会超过40%。逆水解采用高浓度的糖和醇，使平衡向产物方向移动，但由于糖的溶解性问