酶反应原理详解.pptVIP

四、酶活性测定 1、酶活性 酶的催化能力，以酶促反应速度来衡量。 2、酶活性单位 指酶促反应在单位时间（s,min,h）内生成一定量（mg, μg, μmol）的产物或消耗一定量的底物所需的酶量。 一个国际单位（IU ,1976年）：在特定条件下, 1 min内使底物转变 1μmol所需的酶量； 一个催量（kat）：在特定条件下,1 Sec内使底物转变 1mol所需的酶量 1I.U.=16.67?10 -9 kat=16.67 ? 10 -3 ?Kat； 1Kat =6?10 7 I.U. 酶比活：每毫克蛋白所含有的每活力单位数。 3、酶活力测定 包括两个阶段： 反应阶段和测定阶段。 一般采取如下步骤： (1) 根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。 要求底物均匀一致，具有一定的纯度，新鲜配制。 （ 2 ）确定酶促反应的温度，pH 值等条件。 温度可选酶反应最适温度 pH 值应是酶促反应的最适 pH 值反应条件在反应过程中应尽量保持恒定不变。 (3)酶液与底物溶液在规定状态下混合开始反应。 (4)适时测定产物的生成量或底物的减少量。 终止酶反应的方法 ①加热失活：酶反应时间一到立即取出适量的反应液，置于沸水浴中； ②变性失活：酶反应时间一到立即加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等； ③酸碱失活：酶反应时间一到使反应液的 pH 值迅速远离酶催化反应的最适 pH ，从而终止反应； ④低温失活：酶反应时间一到将取出的反应液立即置于冰粒堆中或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低至 10 ℃以下。 固定化酶的活力测定 振荡测定法：称取一定重量的固定化酶，放在一定形状，一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在特定的条件下，一边振荡或搅拌，一边进行催化反应经过一定时间，取出一定量的反应液进行测定。 注意点： （1）在振荡或搅拌速度速度不高时，反应速度随振荡或搅拌速度的增加而升高，在达到一定水平后不再升高。 （2）若速度过大，可能引起固定化酶的结构破坏，缩短固定化酶的使用寿命。 （3）底物浓度， pH 值，温度，反应时间等条件可与游离酶活力测定的条件相同。 例题： 某无细胞的粗提液，每mL含20 mg 蛋白质。在0.5mL的标准总反应体积中，含有10 ?L 这中提取液。在最适宜条件下，一分钟内生成30ng的产物。求： 用下述单位表示反应速度v : nmol/ml /min, nmol/L/min, ?mol/L/min, mol/L/min 若10 ?l该提取液，在1 ml总反应体积中进行实验，其反应速度是多少？ 反应混合液和提取液中酶活性浓度各是多少？ 酶制剂的比活力是多少？ 解： V=30/0.5=60 nmol/ml/min =60 ?10 3 nmol/L/min =60 ?mol/L/min =6 ? 10-5 mol/L/min V=30/1 =30 nmol/ml/min =3 ? 10-5 mol/L/min 反应液酶活性浓度= 60 nmol/ml/min =0.06?mol/ml/min =0.06单位/ml 0.5 ml的反应液内含0.03单位酶，即10 ?l (0.01 ml) 提取液含0.03单位酶，所以： 提取液酶活性浓度=0.03/0.01=3单位/ml 酶比活=3/20=0.05单位/mg蛋白 五、酶的分类与命名 (一) 分类 1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee, EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把蛋白类酶分成6大类： 1. 氧化还原酶类：主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。 AH2 + B（O2） A + BH2（H2O2，H2O） （1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应。 AH2 +B A +BH2（需辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ） （1）米氏方程（Michaelis-Menten equation） V= Vmax [S] Km + [S] 米氏方程解释： 当[S]??Km时，v=(Vmax/Km) [S], 即v 正比于[S] 当[S]??Km时，v ?Vmax, 即[S]?而v不变 米氏方程成立条件： 初速度为标准 单底物 稳态（steady state） （2）米氏方程推导 （3）米氏常数的意义 1、当反应速度等于最大反应