植物基因工程摘要.ppt

植物基因工程 Bt抗虫基因载体构建 一、流程 二、Bt基因简介 三、Bt基因的合成 四、Ti质粒简介 五、Ti质粒改造（酶切、连接和检验） 一、Bt抗虫基因载体构建流程 NCBI查询获取Bt基因序列 以Bt基因为模板设计引物 Bt抗虫基因的合成 PCR、切胶回收 DH5α、PMD—18克隆 LB、Amp筛选 Bt基因 酶切 连接 检验 Ti质粒 二、Bt基因简介 Bt基因即是苏云金芽胞杆菌基因。苏云金芽胞杆菌在外界条件苛刻或营养体老熟时，将进入产胞循环，包裹在芽胞与晶体外侧的细菌壁在后期破裂，释放出自由的芽胞和伴胞晶体；伴胞晶体对鳞翅目和鞘翅目昆虫（比如小菜蛾）有很强的杀伤作用 。 三、Bt基因的合成 通过NCBI数据库获得Bt基因序列，并以此为模板设计引物。 引物的设计通过软件primer5来完成。 引物设计的一般原则 序列选取应在基因的保守区段 。 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构。 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。 五、Ti质粒改造 酶切 连接 检验 5.1 酶切 野生型的Ti质粒作载体时，影响植株再生的直接原因是T-DNA中Onc基因的致瘤作用。因此，为了使野生型的Ti质粒成为基因转化的载体，必须切除T-DNA上的Onc基因。 5.1 酶切 切除T—DNA上的致瘤基因，仅保留两侧边界与T-DNA准确转移所需的25个碱基序列。已经缺失的T-DNA部位被大肠杆菌的一种常用的质粒pBR322取代。这样任何适合于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片段，都可以通过pBR322质粒DNA的同源重组，而被共整合到Onc-Ti质粒载体上。 5.2 酶切位点的处理 用相同的限制内切酶切割Bt基因所在片段和Ti质粒，使目的基因和Ti质粒产生的缺口能够互补而获得酶切序列。设计目的基因引物时酶切位点及保护碱基。 5.3 链接 在连接酶作用下目的基因与大肠杆菌质粒进行连接 培养 连接后将TI质粒转入大肠杆菌中，并在LB+Amp培养基内培养。选择出转化成功的农杆菌继续培养。 5.4 检验 一、酶切检验 ：用上一步中所用的限制内切酶切割质粒，切割下来的片段测序，看是否是目的基因。 二、PCR检验：通过PCR扩增出大量序列，与Marker比较鉴别是否是目的基因。 目的基因转入农杆菌中 大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性，通过制备农杆菌感受态细胞，加入含有目的基因的大肠杆菌质粒，然后在LB+Amp的培养基上选出含有目的基因的农杆菌。 引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高） 四、Ti质粒简介