蛋白质表达纯化概述[精选].ppt

蛋白质表达与纯化概述 第一章：蛋白质 定义：定义1：生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的α氨基酸之间通过α氨基和α羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。 蛋白质按实验室研究分类（其它分类方法不做赘述） 1.天然蛋白 2.重组蛋白 1.1.天然蛋白 定义：存在于自然有机生命体的蛋白质的总称 由于分离纯化工艺繁琐、得率低、难以分离鉴定、成本高等缺陷。基本已经脱离实验室研究，但是在对某蛋白的实验室研究的特定阶段必须分离得到天然蛋白方能进行实验研究，同样某些以天然蛋白为中间产物或生产产品的公司会进行天然蛋白的分离纯化（如化妆品、护肤养生保健品等行业）。 1.2.重组蛋白 定义：通过重组DNA(或RNA)技术获得的蛋白质。 重组蛋白已经广泛应用于实验室研究、蛋白内产品、药物筛选、食品卫生等领域。 第二章 蛋白表达系统 蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。一般由以下几个部分组成： 　　1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。 　　2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。 　　3、辅助成分。帮助重组蛋白表达、修饰、提高稳定性和溶解性的辅助片段等。有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆状病毒。 蛋白质表达有五大表达系统： 1.原核表达系统 2.酵母表达系统 3.昆虫表达系统 4.哺乳表达系统 5.植物表达系统 2.1.原核表达系统 常用原核表达系统为重组大肠杆菌（E.coli） 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统，大肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速产量高、IPTG诱导表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系统。 　　对于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体。 原核表达系统的优缺点 1 原核蛋白表达系统既是最常用的表达系统，也是最经济实惠的蛋白表达系统。 代表：大肠杆菌表达系统。 优点：遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单 缺点：蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠，得到具有生物活性的蛋白的几率较小。 2.2酵母表达系统 酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用，应用此系统可高水平表达蛋白，且具有翻译后修饰功能，故被认可为一种表达大规模蛋白的强有力的工具。 常用的酵母表达系统： 　一，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表达系统 二，甲醇营养型酵母表达系统 酵母表达系统的优缺点 代表：甲醇毕赤酵母 优点：表达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，易实现高密发酵 缺点：部分蛋白产物易降解，表达量不可控 2.3 昆虫表达系统 昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；可表达非常大的外源性基因(一200kD)；具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力；对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。。常用的杆状病毒包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕型多角体病毒(BmNPV)，常用的宿主细胞则来源于草地夜蛾Sf9细胞，用于表达外源基因的质粒来源于PUC系列，其含有一个多克隆位点和多角体蛋白启动子。 昆虫表达系统的优缺点 1，组