【2017年整理】科学仪器学 流式细胞仪.docVIP

流式细胞仪 科研仪器学 第 PAGE 2 页 共 NUMPAGES 19 页 第 PAGE 3 页 共 NUMPAGES 19 页 流式细胞仪 生命科学是一门以实验为基础的学科，要做实验必然少不了仪器设备。仪器设备的好坏也是衡量一个实验室水平的重要标志之一。同学们已经进入大学二年级下的学习，会越来越多地接触到一些科研仪器，今天我们要讲的是其中之一流式细胞仪。 图1 流式细胞仪及流式细胞图 1.1 流式细胞仪基本结构与功能 1.1.1 流式细胞仪基本结构 流式细胞仪(flow cytometer，FCM)是集现代物理电子技术、激光技术、计算机技术于一体的先进科学技术设备，是生命科学研究领域中先进的仪器之一。概括来说，流式细胞术就是利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。它具有如下几个特点：①实现对单列细胞或生物颗粒进行逐个检测。只要标本是单个细胞或生物颗粒，即可用于分析，如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞等，实体组织经处理后制成的单细胞悬液也能分析。②实现高通量检测。只要标本中的细胞或生物颗粒数量足够，短时间内可分析大量细胞或生物颗粒。流式细胞仪可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行检测，被检测的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。③多参数、多色荧光分析对细胞特性的识别、计数更为准确。用不同荧光素标记的单克隆抗体进行多色荧光染色，可同时分析单个细胞或生物颗粒的多种特征，使细胞特性的识别、计数更为准确。④定性或定量分析细胞。通过荧光染色对单个细胞或生物颗粒的某些成分，如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性、细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。⑤分选特定性状或功能的细胞。有些流式细胞仪还具有细胞分选功能，可将具有特定性状或功能的细胞从混合细胞群中分离出来。总之，它具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、分选纯度高、方法灵活等特点。 流式细胞仪的基本结构包括四大模块：流动室与液流系统、光源与光学系统、信号收集与信号转换系统、计算机与分析系统。具有分选功能的流式细胞仪还包括分选系统。 流动室与液流系统 由于流式细胞仪的激发光路是固定的，一般与细胞悬液的轴心正交，这就要求细胞必须在流经激光聚焦区时不能偏离其轴心，且不能聚集成团，阻塞管路，否则光束无法准确照射细胞中心，造成信号不稳定，影响测量结果的精密度。流式细胞仪液流系统成功地解决了上述问题。根据层流原理(层流，laminar flow，是 HYPERLINK /view/84935.htm \t _blank 流体的一种流动状态。流体在 HYPERLINK /view/39467.htm \t _blank 管内 HYPERLINK /view/1216569.htm \t _blank 流动时，其质点沿着与管轴平行的方向作平滑直线运动。此种流动称为层流或 HYPERLINK /view/1316626.htm \t _blank 滞流，亦有称为直线流动的。流体的 HYPERLINK /view/186518.htm \t _blank 流速在管中心处最大，其近壁处最小。管内流体的平均流速与最大流速之比等于0.5)，利用专门设计的流动室(fIow cell)，使样本流与鞘液流形成同轴流动状态。由于样本喷嘴处于流动室中央，这就使得样本流在鞘液流包裹下恒定处于同轴流动的中心位置，其精度可稳定在几微米之内。流动室还根据Bernoulli定律，利用大小两个不同截面，使鞘液从截面积较大部分流经截面积较小的样本流部分，使液流聚焦在入口处，形成检测点。液流系统的心脏是流动室，由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用石英玻璃等透明、稳定的材料制作，设计和制作均很精细。样品管储放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度?10 m/s(图2)。 图2 流动室液流原理与检测点 光源与光学系统 流式细胞仪的检测是基于对光信号的检测来实现的，包括对散射光和荧光的检测，因此光源与光学系统是流式细胞仪中最为重要的一个系统。它由激发光源、一系列光通过和光反射的镜片组成(图3)。 图3 光源与光学系统 (1)激发光源。目前流式细胞仪所用的激发光源包括弧光灯和激光器。弧光灯多为高压汞灯，激光器按产生激光的物质的种类可分为固体激光器、气体激光器、液体激光器和半导体激光器。各种激发光源应该说各有优缺点，没有哪种激发光源可以适于所有的场合，生产厂家在选择何种光源作为激发光的时候主要考虑：分析或分选目的、激发波长的需要、仪器设计等。作为流式细胞仪的激发光源，有两个特性是比较重要的：①单色性和单向