胚胎植入前遗传学诊断..doc

胚胎植入前遗传学诊断 (Preimplantation Genetic Diagnosis ,PGD) 一、定义 胚胎种植前遗传学诊断(PGD)是指在体外受精过程中，对具有遗传风险患者的胚胎进行种植前活检和遗传学分析，以选择无遗传学疾病的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿的诊断方法，可有效地防止有遗传疾病患儿的出生。 植入前遗传学诊断是随着人类辅助生殖技术，即“试管婴儿”技术发展而开展起来的一种新技术，它是产前诊断的延伸，遗传学诊断的又一更有希望的新技术。 二、意义 （一） 对高龄孕妇和高危妇女进行PGD可以有效地避免遗传病患儿的出生。 （二） 可以有效地避免传统的产前诊断技术，对异常胚胎进行治疗性流产，避免中期妊娠遗传诊断及终止妊娠所致的危险及痛苦。 （三） ＰＧＤ技术的产生与完善可以排除遗传病携带者胚胎，阻断致病基因的纵向传递，从而降低人类遗传负荷。 三、适应征 理论上只要有足够的序列信息，ＰＧＤ能针对任何遗传条件进行诊断，即凡是能够被诊断的遗传病都可以通过ＰＧＤ来防止其患儿出生。 进行PGD的主要对象是可能有遗传异常或高危遗传因素，需要产前诊断的病例，尤其是可能同时具有两种以上不同的遗传异常情况。 ＰＧＤ现已用于一些单基因缺陷的特殊诊断，包括Duchenne型肌营养不良、脆性Ｘ综合征、黑朦性白痴(Tay Sachsdiseade)、囊性纤维病(cysticfibrosis)、Rh血型、甲型血友病、镰型细胞贫血和地中海贫血、进行性营养不良、新生儿溶血、21抗蛋白缺乏症，、粘多糖贮积症(ＭＰＳ)、韦霍二氏脊髓性肌萎缩(Werding Hoffman disease)，还有染色体异常如Down’S综合征、18三体，罗氏易位等。 四、植入前遗传学诊断的取材 可从胚胎着床前各个阶段活检取样，获取其遗传物质信息进行诊断。目前多采用激光打孔、机械切割或Tyrode酸化打孔后吸出细胞的方法取材。 （一）极体 极体细胞可以使用第一极体或第二极体，它们在胚胎发育和合子形成中是非必须的，因而不影响卵子受精和正常发育，且不会引起伦理学上的争议。极体活检比胚胎活检对胚胎的创伤性小，且不为染色体的嵌合性所影响，可以间接地反映母源性遗传缺陷。 但极体活检细胞不能检测父源性非整倍体核型或发生于受精期间及受精后的其它异常，例如多倍体、单倍体及嵌合性，而且只能取到一个细胞核进行分析，结果的可靠性有限。 （二） 卵裂球细胞 目前ＰＧＤ多选在卵裂期，即体外受精3天后6～10细胞期进行。取出1-2卵裂细胞进行诊断，其它细胞留待诊断后决定取舍。实验证明，从胚胎中活检出25%的细胞，并不会影响其正常发育;活检成功率可达97%。 胚胎活检可以用于检测母体的非整倍体核型以及父源的非整倍体核型、多倍体、单倍体和广泛的嵌合性，诊断的准确性较高。 （三）囊胚滋养层细胞 有了囊胚培养后：1）可为植入前诊断提供充足的时间; 2）可活检滋养层细胞用于诊断，不影响胚体的发育，且所能获取的细胞数目相对多些(10～30个)，减少嵌合现象干扰。而且此阶段的胚胎基因表达更为完全，增加了诊断的可靠性，是较为理想的PGD材料。 然而受精卵在体外培养，目前只能有50%能达到囊胚。使该时期的PGD受到了限制。尽管引入了激光活检并改善了囊胚培养方法，许多研究中心仍然选择在胚胎发育的第3天进行检查。目前囊胚滋养层细胞活检进行PGD还罕见报道。 五、主要检测技术 单基因病的PGD基本上以PCR技术为基础。染色体原位杂交(FISH)技术的引入，扩大了PGD的诊断范围，特别是间期核单细胞FISH技术的成功，以及多种多样FISH探针的开发，把PGD扩展到了染色体病的诊断。 （一）荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH） 将DNA探针用不同颜色荧光染料标记，与固定在玻片上的卵裂球细胞不同染色体杂交后，在荧光显微镜下被杂交的部分呈现不同颜色的荧光,从而对染色体异常进行筛查。通过FISH技术采用多种探针可诊断男、女性别和性连锁疾病，也可诊断染色体疾病包括数目和结构的畸变。 FISH简要流程。一般每个卵裂球细胞只能标记5条染色体，约需5个多小时。 1)固定卵裂球细胞于玻片上; 2)细胞裂解; 3)脱水; 4)荧光标记探针，并使之与卵裂球染色体杂交; 5)漂洗除去背景染料; 6)加入二氨基苯基吲哚(DAPI)负染(counterstain)，在荧光显微镜下观察。 FISH技术在PGD中的应用 1） 胚胎性别的鉴定,排除性连锁疾病的发生。对于Ｘ连锁隐性遗传病,通过FISH技术鉴定性别,防止后代相应遗传病的发生。 2) 染色体疾病包括数目和结构的畸变。 3、FISH技术在ＰＧＤ的应用中还存在一些亟待解决的问题 1)受ＤＮＡ探针荧光素染料的限制,每个卵裂球只能用