实验一、载体!类型与质粒DNA的提取、分离和纯化.pptVIP

实验一、质粒DNA的提取、分离和纯化 1、质粒与载体的基本知识 载体（vector）: 把一个有用的目的DNA片段通过重组 DNA 技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具。 载体的基本类型： 质粒（plasmid）：重组DNA技术中最常见的载体。 ?噬菌体（? phage）： Cosmid： BAC (bacterial artificial chromosome) YAC (yeast artificial chromosome) 其它 质粒的基本性质： 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、共价闭合环状DNA分子cccDNA，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主的复制和转录系统，但质粒的复制和转录需要宿主细胞编码的某些酶和蛋白质。此外，质粒还具有编码某些酶的基因，如对抗生素的抗性等。 质粒在细胞内的复制一般有二种：紧密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上。在细胞培养过程中，加适当氯霉素可使松弛型质粒的拷贝数由原来的20多个扩增至1000-3000个。 质粒的不相容性（incompatibility） 利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时进入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞过程中相互竞争，只有一种质粒占优势。这样，过几代后，占小数的质粒将丢失，在细胞后代中只有二种质粒中的一种。这种现象称为质粒的不相容性（incompatibility）。但利用不同复制系统的不同质粒可在同一宿主细胞中共同存在。 质粒载体的基本特性和要求 . 分子量小、多拷贝、松弛控制型 . 具有多种常用的限制性内切酶的单切点。 . 能插入较大的外源DNA片段 . 具有容易操作的检测表型。 pBluescript SK(+/-)质粒载体（pBS） 基本结构: . ColE1 origin . Ampicillin . Fi origin . MCS (多克隆位点) . LacZ ?噬菌体（? phage） ?噬菌体为一种侵染细菌的病毒,病毒 颗粒有一个包裹着48.5Kb的线性双链 DNA基因组的二十面体的头部,一个长 的柔韧的尾部. 在感染的细胞内, ?噬菌体既可 以以裂解性的生活周期,也可以是溶原 性的生物周期(基因组整合进宿主基因组). 病毒颗粒内的基因组是线状的,但它的两端是单链 且互补被称作 cos末端(cos end, 由12bp构成的粘性末端).一旦进入细胞,两个cos末端就会迅速相互结合,形成有缺口的环状基因组,细胞的DNA连接酶可修补该缺口. ?噬菌体（? phage） 在48.5Kb的?基因组中,中心区域的大部分对侵染裂解都是不必要的,可以被不相关的DNA序列所替换,不过DNA的总长度必须是原长度的75%-105%之间,即37-52kb.考虑到必要区域,可克隆进入?噬菌体的DNA片段大约为20kb(最大为23kb)左右. 至今已用?噬菌体开发出许多插入型和置换型载体 插入型载体: ?ZAP, ?gt 10, ?gt 11等 置换型载体: ?GEM-11, ?GEM-12, ?EMBL3, ?EMBL4等. 与一般的质粒载体不同, ?噬菌体转染前需要利用噬菌体外壳蛋白和噬菌体DNA加工酶组成的混合物(包装抽提物)在体外将连接好的DNA线性分子包装成噬菌体颗粒. Cosmid 利用质粒分子形式,且利用了噬菌体的cos位点的特性.体外将DNA包装入噬菌体颗粒仅要求cos位点在线性DNA上有正确的距离(37-52kb). 最原始的Cosmid载体是一个正常的小质粒,包含一个复制起点(ori)、选择性标记及一个cos位点和一个用于克隆的限制性位点. 与目的片段DNA连接后, DNA被包装进入噬菌体颗粒. 感染后经cos 位点配对, DNA 重新环化, 象正常质粒一样扩增. 细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC) BAC是一些环状DNA分子。每个环状D