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RNA干扰技术基本原理与应用 什么是RNA干扰 RNA干扰(RNA interference，RNAi),又称转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)，是指将特异性同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，使目的基因的不表达或表达水平下降. 目前应用的基因干扰技术 DNA水平的基因干扰技术 基因敲除技术 寡核苷酸与双链DNA 杂交 采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子 目前应用的基因干扰技术 mRNA水平的基因干扰技术 用反义RNA 技术阻遏翻译过程, 破坏内源性mRNA 设计寡核苷酸来破坏与mRNA 结合的蛋白质, 使mRNA 不稳定 双链RNA 干扰技术（RNAi） RNAi的发现和发展历程 1984 年,Jonathan 研究小鼠L 细胞时发现反义mRNA 会干扰同源基因的表达，机制不清 1990年 Jorgensen等 矮牵牛颜色加深实验 “共抑制(co-suppresion)” RNAi的发现和发展历程 1995年 Su Guo 和Ken Emphues 反义RNA阻断秀丽小杆线虫par-1基因的表达 实验 首次发现 RNA干扰现象 1998年 Andrew Fire和Craig Mello 发现单链RNA抑制作用较弱，而纯化的dsRNA可高效、特异地抑制基因的表达 Nature1998； 391: 806-11 正式提出RNA干扰的概念 RNAi的发现和发展历程 1999年 Tuschl等 报道在哺乳动物中也存在RNAi 2001 年 Berstein 等 提出只有22 核苷酸dsRNA才有特异性的阻断效应，并发现体内分解dsRNA 为siRNAs (short/small interfering RNA) 的DICER 酶 RNAi的发现和发展历程 2002 年 Novina 等 用RNAi 技术实现了对HIV-1 病毒的阻抑 2004年 Morris 等 用RNAi技术实现了对人细胞基因的抑制 Science 2004(August 27)；305：1289-1292 RNAi的主要特点和优势 诱导转录后水平的基因沉默 具有高度的特异性 抑制基因表达的高效性可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去 “基因沉默系统化” siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶 共同点 特异性 靶向性 siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶 不同点 独特的双链结构 需要Dicer、RdRp 、解旋酶、激酶等协同因子 siRNA 本身无催化活性 在细胞内可能具有相对的稳定性 具有一定的可遗传性 RNAi的主要过程 启动阶段 dsRNA (500nt左右最佳)被Dicer 酶特异性识别，以一种ATP依赖的方式逐步切割成siRNA 长度：21-25nt 结构：3ˊ端悬垂两个未配对的碱基UU 细胞中内源性dsRNA的形成 基因组中DNA 反向重复序列的转录产物 同时转录反义和正义RNA 病毒RNA 复制中间体 以单链RNA 为模板由细胞或病毒的RNA 依赖RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA Dicer酶 RNAase III超家族成员。结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点 对单链RNA没有活性 对200~500nt的dsRNA作用效果最好，能降解成25nt左右的siRNA 广泛存在 RdRp（RNA dependent RNA polymerase） 使异常的RNA转变为dsRNA 参与细胞内dsRNA和siRNA的扩增 siRNA与靶mRNA 的结合可激活RdRp，形成大量的dsRNA RNAi的主要过程 效应阶段 RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC） 的形成 RISC的激活：ATP依赖的解双链过程 在siRNA反义链的指导下(靶序列的识别），RISC特异性切 割、降解靶mRNA，导致基因表达失活 RNAi技术的实验方法 siRNA的设计原则 序列大小 19-21nt ，最好以A或G开始 从mRNA的AUG开始，寻找AA二连序列，作为潜在的RNAi靶位点 不要针对5‘和3’端非编码区（untranslated regions，UTRs) RNAi技术的实验方法 siRNA的设计原则 设计2~4个序列, BLAST 比对基因序列以确保序列设计的特异性 优先选择 GC 含量30-50%的序列 设计适当的阴性对照序列 阴性对照序列的设计 特异性siRNA中的碱基进行随机排列，且行BLA