培训感言[精选].docxVIP

暑期实习感言吉林农业大学生命科学学院生物技术三班吕悦实习感言在这次实习中我们收获颇多，因为我不仅学到了知识，也学到了技术。在这里我感到了快乐与成就，还有朋友的重要性。实习中我们得到了很多技术。流程巢式PCR，或正式PCR。胶回收技术，得完整片段。酶切片段，目的基因与载体同时切。连接，转化。PCR验证，得阳性结果。摇匀，提质粒。PCR酶切，用3步中的酶验证。测序。载体构建。PCR的反应步骤：变性-退火-延伸实验步骤RNA提取流程1.适量的动植物组织或培养细胞2．加入适量的RNAiso Plus后匀浆室温静置5分钟3．12,000 g 4℃离心 5 分钟，上清转移至新的1.5 ml tube中4.加入1/5 RNAiso Plus体积量的氯仿5.振荡混匀室温静置5分钟6.12,000 g 4℃离心 15 分钟将上清液转移至新的离心管中7.加入与上清液等体积的异丙醇室温静置10分钟8.12,000 g 4℃离心 10 分钟向沉淀中加入1 ml的75%乙醇清洗沉淀9.12,000 g 4℃离心 5 分钟弃上清保留沉淀10.干燥溶解于适量的DEPC处理水中二）第一链CDNA合成1.在冰玉下进行，按以下顺序。1）模板总RNA 10ng-5ng 或poly(a)RNA 1ng-500ng或特异性RNA0.01pg-0.5vg2)引物 oligo(dt)0.5vg(100pmol) 随机六聚体引物0.2vg(100pmol) 基因特异性引物15-20pmol3）DEPC-处理水至12.5vl2.可选步骤。3.指定顺序加入以下成分。1）Total RNA/mRNA 50 ng-5 μg/5-500 ng2）Anchored Oligo(dT)18(0.5 μg /μl) 1 μl3）or Random Primer(N9)(0.1 μg/μl) 1μl4）or GSP 2 pmol5）2×ES Reaction Mix 10 μl6）EasyScript RT/RIEnzymeMix 1 μ7）RNase-free Water to 20μ 4、轻轻混匀如用Anchored Oligo(dT)18或基因特异引物（GSP），42°C孵育30min。如用Random primer，25°C孵育10min，42°C孵育30min。5、85°C加热5 min失活EasyScript RT。三）胶回收在含合适抗生素的培养基中接种目标菌株，于37℃摇床充分振荡培养12-16h。菌液状态对质粒得率非常关键，请用不超过容器容量1/4体积的培养基进行培养。处于生长平台期的菌体用于质粒抽提得率最高，过度培养可能导致DNA降解。2.对于高拷贝质粒，取1.5-5 ml菌液，于室温，8,000 ×g离心2 min收集菌体，倒尽或吸干培养基。※对于高拷贝质粒，从5 ml过夜菌液中通常可以获得超过20 μg质粒DNA，不推荐使用更大的菌液量。※对于低拷贝质粒，如果使用更多的菌液，则同一个样品分多管收集，每管不超过5ml，分别裂解，合并同一个样品的各管裂解液通过同一个吸附柱来获得更高的得率。3.在菌体沉淀中加入250 μl Buffer P1，吸打或振荡至彻底悬浮菌体。Buffer P1 首次使用时请检查是否已加入 RNase A一定要彻底悬浮菌体，否则影响得率和质量如果使用VisualLyse，则在加入250 μl P1后再加入1 μl VisualLyse，振荡混匀VisualLyse 需在临用前加入，直接加入到 Buffer P1 中出现浑浊为正常现象3.加入250 μl Buffer P2，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min。裂解时间与菌量相关，菌量多则适当延长时间，最长不能超过5分钟如果同时操作多个样品，每加入一管混匀一管，不要采用全部加入一起混匀的方法，计时从第一管样品加入开始4.加入350 μl Buffer P3，立即温和颠倒离心管5-10次充分混匀如果同时操作多个样品，每加入一管混匀一管，不要采用全部加入一起混匀的方法※Buffer P1 首次使用时请检查是否已加入 RNase A。※一定要彻底悬浮菌体，否则影响得率和质量。※如果使用VisualLyse，则在加入250 μl P1后再加入1 μl VisualLyse，振荡混匀。※VisualLyse 需在临用前加入，直接加入到 Buffer P1 中出现浑浊为正常现象。四）连接转化特点※Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞是目前生长速度最快的感受态细胞，在氨苄青霉素平板上，8-9 h可见克隆；※用于蓝、白斑筛选，12 h可见蓝斑；※将过夜培养的单克隆在2 ml的LB培养基中培养4-5 h