第一代基因测序研究报告.ppt

第一代DNA序列测定 DNA测序技术的诞生和发展 1980年，Sanger和Gilbert 因建立DNA测序技术而获得诺 贝尔化学奖（Sanger是第2次获得诺贝尔化学奖 ）。 1977年，美国哈佛大学生化学家Walter Gilbert发明DNA化学降解法测序技术(Maxam 和Gilbert,1977)。 1977年，英国剑桥医学研究会的分子生物学实验室Frederick Sanger 发明双脱氧链终止法DNA测序技术(Sanger和Coulson)。 DNA测序技术的诞生（第一代DNA测序技术） 1.1 化学降解法 在该方法中，一个末端被放射性标记的DNA片段在5组互相独立的化学反应中分别被部分降解，其中每一组反应特异地针对某种碱基。因此生成 5 组放射性标记的分子，每组混合物中均含有长短不一的 DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原 DNA片段上的位置。最后，各组混合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。 1.1 化学降解法 准确性较好，易掌握，因此用得较多。且所测序列来自DNA分子而不是酶促合成产生的拷贝，排除了合成时造成的错误。但化学降解法操作过程较麻烦，逐渐被简便快速的 Sanger法所代替。 双脱氧法(Dudeoxy sequence analyses) 双脱氧法又称末端终止法，用于单链测序 1977年Sanger 利用此原理建立了双脱氧测序法 原理：与加减法相似，但不再是加一种dNTP或减一种dNTP,而是加入某一种双脱氧核苷，来终止聚合反应。 1.2 双脱氧链终止法 Sanger法：简便、快速，经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。 1.2 双脱氧链终止法 1.3 荧光自动测序技术 荧光自动测序技术基于 Sanger原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测 ，从而大大提高了DNA测序的速度和准确性。 1.4 杂交测序技术 杂交法测序是 20世纪 80年代末出现的一种测序方法，是利用DNA杂交原理，将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上，把待测的 DNA样品片段变性后与其杂交，根据杂交情况排列出样品的序列信息。 检测速度快，成本低，具有部分第二代测序技术的特点。但该方法误差较大，且不能重复测定。 双脱氧链终止法 双脱氧链终止法又称为 Sanger法，该方法的原理是：核酸模板在 DNA聚合酶、引物、4种单脱氧核苷三磷酸 (dNTP,其中的一种用放射性 P32标记 ) 存在条件下复制时,在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP)，因为双脱氧核苷没有 3′-OH，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端,该链就停止延长 。 双脱氧链终止法 如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为 3端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分 4个泳道进行凝胶电泳， 分离长短不一的核酸片段 ，长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后，根据片段 3′端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。 双脱氧链终止法 双脱氧链终止法 双脱氧链终止法 双脱氧链终止法 Seq 双脱氧链终止法