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生物技术药物总结第一讲总论生物技术药物(Biotechdrugs or Biopharmaceuticals)：指采用生物技术生产的用于疾病的预防、治疗和诊断的制品。生物技术：指以现代生命科学为基础，结合其他基础科学的科学原理，采用先进的科学技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。主要包括：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程、抗体工程。生物技术药物分类（按化学特性）：天然生物技术药物；重组活性蛋白、多肽；基因药物（核酸药物）第二讲基因工程基本过程与方法（一）原核表达载体（大肠杆菌）功能元件：启动子及调控序列、核糖体结合位点、松弛型复制子、转录终止区、多克隆位点、筛选标记哺乳动物细胞表达载体功能元件：原核DNA序列、启动子、终止子和多聚腺苷化信号、拼接信号、筛选标记第三讲基因工程基本过程与方法（二）——基因文库的构建、基因工程中的常用酶、DNA测序cDNA文库：指通过克隆的方法保存在宿主中的一群混合分子，这些分子中的插入片段的总和可代表某种生物全部mRNA序列。cDNA基因文库构建的步骤：①细胞总RNA的提取和mRNA的分离；②第一条cDNA合成：oligo(dT)引物引导的DNA合成法、随机引物合成法、特定寡核苷酸引物合成法；③第二条cDNA合成：自身引物合成法、置换合成法、外加引物合成法④双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖限制性核酸内切酶（同尾酶）：一类能识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列并能切割DNA双链的核酸内切酶。识别序列特点：多数具有严格的识别序列；识别序列的长度:4~8个碱基对；序列特征：回文序列第四讲基因工程基本过程与方法（三）——细胞转化与转染连接子导入受体细胞：转化：将质粒或DNA导入宿主细胞，引起细胞遗传的改变。转染：真核细胞的转化转导：通过噬菌体(或病毒)将宿主基因从一个细胞转移到另一个不同基因型的细胞中。※常用方法：原核细胞：CaCl2感受态法、噬菌体体外包装法真核细胞：电穿孔法、DNA-磷酸钙共沉淀法、脂质体介导法、显微注射法CaCl2感受态法：适用于革兰氏阴性细菌。原理：是钙离子与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲（Heat Shock)发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，使DNA分子能够通过。优点：操作方便缺点：转化效率较低重组体克隆的筛选与鉴定：抗药性标记筛选、※兰-白斑筛选（α-互补）、 DNA电泳检测α-互补：将缺陷α-半乳糖苷酶N端部分序列的质粒载体转入缺陷α-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主菌，并且在含有X-gal的培养基上选择性培养，用乳糖类似物IPTG作为安慰性诱导剂进行诱导。质粒转入宿主菌后，宿主与质粒产生的有缺陷的α-半乳糖苷酶之间可以形成互补，对X-gal进行降解可产生蓝色菌落，这就是α-互补现象。定点突变：1、盒式诱变：利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。2、寡核苷酸引物诱变：指应用合成的寡核苷酸片段作为诱变剂，诱发基因或DNA片段中特定位点发生突变的技术。3、PCR诱变寡聚核苷酸介导的突变盒式突变PCR介导的突变优点保真度高简单易行突变效率高操作简单突变成功率高缺点突变效率相对低操作复杂周期长受到酶切位点的限制后续工作复杂TaqDNA 聚合酶保真性偏低第五讲原核表达系统启动子（promotor）：是RNA聚合酶结合并启动转录的特异DNA序列。核糖体结合位点（RBS）：遗传信息翻译成多肽链起始于mRNA上的核糖体结合位点（RBS）。它是起始密码子AUG上游的一段非翻译区序列。常用的启动子转录调控系统Plac转录调控系统：弱, IPTG诱导 PL和 PR转录调控系统: 强，热诱导Ptrp转录调控系统: 强，吲哚丙烯酸Ptac转录调控系统：强，IPTG诱导PT7转录调控系统：转录活性高，特异性强；IPTG诱导表达形式：蛋白质结构：非融合型表达：天然完整蛋白融合型表达：如GST融合表达蛋白融合型表达：如GST融合表达蛋白优点：1、转录和翻译的起始由正常的大肠杆菌序列调控，表达效率较高2、融合蛋白较天然真核蛋白更稳定3、可以利用识别原核肽段的配体进行亲和层析纯化4、融合蛋白分子量大，易于电泳鉴定表达部位：包涵体、周质表达包涵体：存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。形成原因：目的基因的高表达，使蛋白无足够时间进行肽链折叠，产生凝集；种种原因引起的蛋白不能正确折叠；蛋白的性质；温度、pH值等环境条件的影响等。特点：1. 简化外源基因表达产物的分离操作：2. 能在一定程度上保持表达产物的结构稳定周质分泌表达的特点分泌后的蛋白产物不含氨基端甲硫氨酸原核生物细胞质中的还原环境不利于蛋白二硫键的形成，而氧化性的周质间隙可以模拟真核细胞的内质网环境，便