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线虫的培养及其发育过程的观察.
线虫的培养及其发育过程的观察
实验原理
秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegan)属于线虫动物门(Nematoda)隐杆线虫属(Caenorhabditis)秀丽隐杆线虫种(C.elegans),根据命名法则中的二名法命名为Caenorhabditis elegans。上世纪六七十年代分子遗传学的奠基人之一Sydney Brenner将线虫作为分子生物学和发育生物学的研究的模式生物。C.elegans为蠕虫状,长度约1mm,/
(一)C.elegans的基本结构以及生活史
C.elegans有雌雄同体(XX)和雄虫(XO)两种性别,在自然条件下, 成虫大多为雌雄同体,雄虫的个体数只占大约千分之一。其基本的结构包括口、咽、肠、性腺以及胶原蛋白角质层,雌雄同体有两个卵巢、输卵管、储精囊,及单一一个子宫(图1,2),雄性有个单叶的性腺、输精管及一个特化为交配用的尾部(图3,4)。
C.elegans是唯一一个身体中的所有细胞能被逐个盘点并各归其类的生物。幼虫含有556个体细胞和2个原始生殖细胞它的成虫则根据性别不同具有不同的细胞数。最常见的雌雄同体成虫成熟后含有959个体细胞和2000个生殖细胞而较少见的雄性成虫则只有1031个体细胞和1000个生殖细胞。C. elegans有五对常染色体和一对性染色体是一个染色体数很少的二倍体。
图2 雌雄同体线虫
A.DIC(微分干涉显微镜)拍摄的图;
B. 雌雄同体线虫解剖示意图
图3 雄虫
A. 雄虫解剖示意图;
B. DIC(微分干涉显微镜)拍摄的图;
C. 性腺放大图;
D. 尾巴放大图;
E. L3时期雄虫尾巴图(上面是雄虫尾巴,下面是雌雄同体的尾巴)
图4:电镜下的雄虫
C.elegans的生活史包括胚胎期、幼虫期(L1-L4)、成虫期三个阶段(如图6)。一个雌雄同体线虫一生约可以产300个卵,卵经过L1、L2、L3、L4 4个幼虫时期,进入成虫期,如果外部条件比较恶劣,比如:拥挤、缺乏食物等,线虫会进入一个特殊的L3时期——dauer时期来抵抗外部的不良环境。C.elegans在实验室20-22℃的条件下,约3.5天长成成虫,可存活两到三周。线虫可以自体受精,当卵母细胞经过贮精囊时受精,也可以接受雄虫的精子进行异体受精(图5)。
图5 雄虫和雌雄同体线虫交配
根据实验需要,可将线虫饲养在固体培养基或者液体培养基中。
图6 22℃下秀丽隐杆线虫E. coli OP50、LB固体培养基、LB液体培养基、NGM培养基等。
实验步骤
线虫培养板的准备:
(1)配置NGM(Nematode Growth Medium)线虫基本培养基
A. 配置以下试剂
1M KPO4缓冲液:108.3 g KH2PO4、35.6 g K2HPO4加水至1升(高压灭菌)
1M MgSO4(高压灭菌)
1M CaCl2(高压灭菌)
5 mg/ml胆固醇(用无水乙醇配置,配完后,过滤,4℃保存)
B. 称取3g NaCl 、2.5g蛋白胨 、20g Agar 到锥形瓶中,加入975ml H2O,高压灭菌,121℃ 20 min
C. 待培养基冷却至55℃时,加入25 ml 1 M KPO4缓冲液、1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4、1 ml 5 mg/ml 胆固醇, 混匀。
D. 将混匀的培养基倒入线虫培养皿中,约2/3培养皿高度。室温放置过夜。
(2)线虫食物的准备:
A. 配置LB液体培养基:
称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl到锥形瓶中,加入1L H2O,调PH值到7.0,高压灭菌
B. 吸取灭菌后的5ml LB液体培养基到10ml已灭菌的管中,挑取op50单克隆到液体LB中,37℃ 振荡过夜(10-15 h)。菌液可4℃保存2周。
(3)每个NGM平板中滴入200μl的菌液,室温放置过夜,即可用于线虫的培养。
2、线虫的观察:
每个小组在解剖显微镜下,对观察用线虫(主要是N2)按照下列提纲进行观察:
认识线虫的各主要组织器官:头部、尾部、咽、肠、子宫;
区别雌雄同体以及雄虫;
观察线虫的运动方式;
观察线虫的进食、产卵(线虫约20分钟产一次卵,每次可连续产5-10个卵)等行为;
区分各个发育时期的线虫。
普通解剖显微镜下线虫特点(图9):
雌雄同体成虫:长约1110-1150μm,显微镜下可见子宫里面有排列规则的卵;
雄虫:个体较雌雄同体短,身体细长,爬行速度快,最主要是其尾部,雄虫的尾部像扇子一样,雌雄同体尾部细长(图3,4)。
L1幼虫:长约250μm
L2幼虫:长约360-380μm
L3幼虫:长
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