线虫的培养及其发育过程的观察..docVIP

线虫的培养及其发育过程的观察 实验原理 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegan）属于线虫动物门（Nematoda）隐杆线虫属（Caenorhabditis）秀丽隐杆线虫种（C.elegans），根据命名法则中的二名法命名为Caenorhabditis elegans。上世纪六七十年代分子遗传学的奠基人之一Sydney Brenner将线虫作为分子生物学和发育生物学的研究的模式生物。C.elegans为蠕虫状，长度约1mm，/ （一）C.elegans的基本结构以及生活史 C.elegans有雌雄同体（XX）和雄虫(XO)两种性别，在自然条件下， 成虫大多为雌雄同体，雄虫的个体数只占大约千分之一。其基本的结构包括口、咽、肠、性腺以及胶原蛋白角质层，雌雄同体有两个卵巢、输卵管、储精囊，及单一一个子宫（图1，2），雄性有个单叶的性腺、输精管及一个特化为交配用的尾部（图3，4）。 C.elegans是唯一一个身体中的所有细胞能被逐个盘点并各归其类的生物。幼虫含有556个体细胞和2个原始生殖细胞它的成虫则根据性别不同具有不同的细胞数。最常见的雌雄同体成虫成熟后含有959个体细胞和2000个生殖细胞而较少见的雄性成虫则只有1031个体细胞和1000个生殖细胞。C. elegans有五对常染色体和一对性染色体是一个染色体数很少的二倍体。 图2 雌雄同体线虫 A．DIC（微分干涉显微镜）拍摄的图； B. 雌雄同体线虫解剖示意图 图3 雄虫 A. 雄虫解剖示意图； B. DIC（微分干涉显微镜）拍摄的图； C. 性腺放大图； D. 尾巴放大图； E. L3时期雄虫尾巴图（上面是雄虫尾巴，下面是雌雄同体的尾巴） 图4：电镜下的雄虫 C.elegans的生活史包括胚胎期、幼虫期（L1-L4）、成虫期三个阶段（如图6）。一个雌雄同体线虫一生约可以产300个卵，卵经过L1、L2、L3、L4 4个幼虫时期，进入成虫期，如果外部条件比较恶劣，比如：拥挤、缺乏食物等，线虫会进入一个特殊的L3时期——dauer时期来抵抗外部的不良环境。C.elegans在实验室20-22℃的条件下，约3.5天长成成虫，可存活两到三周。线虫可以自体受精，当卵母细胞经过贮精囊时受精，也可以接受雄虫的精子进行异体受精（图5）。 图5 雄虫和雌雄同体线虫交配 根据实验需要，可将线虫饲养在固体培养基或者液体培养基中。 图6 22℃下秀丽隐杆线虫E. coli OP50、LB固体培养基、LB液体培养基、NGM培养基等。 实验步骤 线虫培养板的准备： （1）配置NGM(Nematode Growth Medium)线虫基本培养基 A. 配置以下试剂 1M KPO4缓冲液：108.3 g KH2PO4、35.6 g K2HPO4加水至1升（高压灭菌） 1M MgSO4（高压灭菌） 1M CaCl2（高压灭菌） 5 mg/ml胆固醇（用无水乙醇配置，配完后，过滤，4℃保存） B. 称取3g NaCl 、2.5g蛋白胨 、20g Agar 到锥形瓶中，加入975ml H2O，高压灭菌，121℃ 20 min C. 待培养基冷却至55℃时，加入25 ml 1 M KPO4缓冲液、1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4、1 ml 5 mg/ml 胆固醇, 混匀。 D. 将混匀的培养基倒入线虫培养皿中，约2/3培养皿高度。室温放置过夜。 （2）线虫食物的准备： A. 配置LB液体培养基： 称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl到锥形瓶中，加入1L H2O，调PH值到7.0，高压灭菌 B. 吸取灭菌后的5ml LB液体培养基到10ml已灭菌的管中，挑取op50单克隆到液体LB中，37℃ 振荡过夜(10-15 h)。菌液可4℃保存2周。 （3）每个NGM平板中滴入200μl的菌液，室温放置过夜，即可用于线虫的培养。 2、线虫的观察： 每个小组在解剖显微镜下，对观察用线虫（主要是N2）按照下列提纲进行观察： 认识线虫的各主要组织器官：头部、尾部、咽、肠、子宫； 区别雌雄同体以及雄虫； 观察线虫的运动方式； 观察线虫的进食、产卵（线虫约20分钟产一次卵，每次可连续产5-10个卵）等行为； 区分各个发育时期的线虫。 普通解剖显微镜下线虫特点（图9）： 雌雄同体成虫：长约1110-1150μm，显微镜下可见子宫里面有排列规则的卵； 雄虫：个体较雌雄同体短，身体细长，爬行速度快，最主要是其尾部，雄虫的尾部像扇子一样，雌雄同体尾部细长（图3，4）。 L1幼虫：长约250μm L2幼虫：长约360-380μm L3幼虫：长