第13章 工遗传病的诊断.pptVIP

3.注意新的基因突变 没有家族史的先证者应考虑是新的基因突变。 例如：假肥大型肌营养不良（ DMD）约有1/3的病例为新的基因突变引起的。一般认为是由于患者母亲卵子形成过程中X染色体上DMD基因突变所致。 2. Y染色质检查 Y染色质检查适用于具有一个或一个以上Y染色体的个体或细胞群。如正常男性只有一个Y小体而XYY男性有2个Y小体。 可用于性别的鉴定。 利用FISH技术诊断Down综合征 图示：利用21号染色体特异性探针对一位高龄妊娠妇女进行产前诊断，未培养的羊水细胞进行荧光原位杂交, 显示所检测的细胞均有 杂交方法： Southern杂交 Northern杂交 斑点杂交 液相杂交 夹心杂交 原位杂交 寡核苷酸探针杂交 当致病基因的某种突变类型与发病有直接的因果关系,或者对致病基因以及分子机制已完全了解,或者对致病基因以及分子机制部分了解但已知其中规律,可应用此途径。 连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种DNA多态性位，特别是基因突变部位或紧邻的多态性位点作为标记。RFLP、VNTR、SSCP、AMP－FLP等技术均可用于连锁分析。 分子杂交技术 molecular hybridization 原理：双链DNA在加热到一定温度以上或在碱性溶液中会变性成为两条单链，互补的两条DNA单链在一定条件下结合成为双链。即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。 因此 ，当一段已知基因的核酸序列作为探针，与变性后的单链DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。 基因探针（Probe）： 是一段带有标记的，与待测基因有关的核酸序列。 探针种类: 基因组探针（genomic probe） cDNA探针（cDNA probe） 寡核苷酸探针（oligonucleotide probe） 1.Southern印迹杂交 - + 2.斑点杂交法 又称等位基因特异的寡核苷酸(ASO)探针杂交。 用人工合成的20个碱基左右长度的ASO探针，一般要合成两种探针：正常探针，突变探针。 将待测的细胞或DNA直接点在硝酸纤维膜或尼龙膜上，将标记有同位素（或其他标记）的变性探针与其进行杂交，通过放射自显影，判断受检基因的有无以及基因的拷贝数，进行基因诊断。 ASO斑点杂交 1986年，胡流清等基于点突变原理，用寡核苷酸探针进行基因诊断。 正常探针 突变探针 PKU，AR 聚合酶链反应 polymerase chain reaction，PCR 聚合酶链反应技术是在体外迅速的选择扩增特定的靶DNA的方法。又称体外DNA克隆技术。PCR的原理： （1）按靶DNA片段的5`和3`端的碱基顺序各合成两条引物（长约20个碱基的寡核苷酸）； （2）将待测DNA变性后，加入四种单核苷酸（dNTP），引物和耐热DNA聚合酶（Taq 酶）； （3）反应液进行热 循环，每一周期经过 变性（92-95℃）， 复性（40-60℃）和 延伸（65-72℃）三 个阶段产生倍增的DNA。 一般进行20-40个周期。 PCR相关技术及应用： 多重PCR RT-PCR Amp-FLP PCR-ASO PCR-SSCP 定量PCR PCR-DGGE PCR-SSCP 1989年，Orita等建立的PCR产物单链DNA凝胶电泳技术。 1 2 3 4 5 a b 1：正常人 2,4,5：纯合体患者 3：杂合体(2的弟弟) 左为泳动变位模式：a 正常人；b 纯合体患者 PCR-SSCP GAA→GAG TGT→TAT CTC→CAC DNA测序技术(DNA sequenceing Maxan和Gilbert首先建立了化学方法，Sanger建立了DNA测序的酶学方法。 最新的DNA自动测序法以不同荧光色素标记的四种不同脱氧核苷酸为原料进行酶促合成反应，经过凝胶电泳分离，应用激光分析及计算机处理就能直接读出碱基顺序。极大地推进了生命科学的发展和人类基因组计划的进程，而且测序的长度可以达到1000bp以上。 DNA测序（DNA Sequencing)是检测未知突变和已知突变基因的最基本和最重要的实验手段。 基因芯片技术 　 基因芯片技术是近年 来发展十分迅速的大规模、 高通量分子检测技术。