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1、用于基因治疗的基因转移途径和方法有哪些？ （1）经活体，即将靶细胞经体外导入外源基因及体外增殖、筛选、药物或其他处理操作后，再输回试验个体体内。 （2）活体内：即将含外源基因的重组病毒在确保不存在复制型病毒的前提下直接应用于试验个体，此外还包括将脂质体包埋或裸露DNA直接注射到试验个体体内等方法。 经活体基因转移途径比较经典、安全，同时治疗效果比较容易控制，但操作步骤多，技术较复杂，不容易推广；活体内基因转移途径操作简便，容易推广。虽然活体内基因转移途径目前尚不成熟，未能彻底解决疗效短、免疫排斥以及安全性等问题，但仍是基因转移途径研究的重点方向，只有这种方法完善成熟以后，人类基因治疗才能真正应用于临床。用于基因治疗的基因转移方法主要包括生物学方法（①至④）和生物学方法（⑤至③）：①逆转录病毒载体介导法（随机整和，具有破坏细胞生长的必需基因、破坏抑癌基因、激活原癌基因等潜在危险。）；②腺病毒载体介导法（不整和，安全性较高；不能稳定表达。）；③腺相关病毒（AAV）载体介导法（可靶向整和，不能独立复制，对人类无致病性，不激活原癌基因。）；④单纯疱疹病毒（HSV）载体介导法（可感染非分裂细胞，对感染细胞产生毒性，HSV的感染往往会导致非神经性宿主细胞蛋白质翻译的关闭和mRNA的降解。）；⑤脂质体介导法（利用阳离子脂质体单体包埋外源DNA，通过细胞内吞作用将外源DNA转移至细胞内。）；⑥直接注射法（将裸露基因DNA直接注入或将DNA团块植入肌肉或某些器官组织。）；⑦受体介导基因转移法（受体介导的细胞内吞作用，具有细胞、组织或器官专一性。）；⑧其它方法（磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、细胞核显微注射法、基因枪颗粒轰击法等。）。 2、接受基因治疗的遗传病的条件及已进行基因治疗研究的遗传病有哪些？ 接受基因治疗的遗传病的条件包括：、 在DNA水平明确其发病原因及机制，相关基因已被克隆； (2) 必须是单基因遗传病，且属隐性遗传； 该单基因遗传病基因的表达不需要精确的调控； 该单基因遗传病基因在便于临床操作的组织细胞中表达并发挥其生理作用； 单基因遗传病不经治疗有严重后果。a 已进行基因治疗研究的遗传病包括：ADA缺乏症、地贫和血红蛋白病、血友病和其它血浆蛋白缺乏症、苯丙酮酸尿症和先天性代谢缺陷病、莱—纳综合症、囊性纤维化病等。 3、什么是DNA序列分析及双脱氧法测定DNA序列的原理？ DNA序列分析即测定DNA链中四种核苷酸（碱基）的排列顺序。DNA测序技术是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳能使相差一个碱基的单链DNA分离开来。对于一个待测序列的DNA片段，需要使其转变成带标记的相差一个碱基的单链DNA，其一端为一固定的末端，而另一端由于长度不同而成为一系列相差一个碱基的连续末端。测序反应使用特异引物与单链DNA模板结合，由DNA聚合酶催化引物延伸，当遇到双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）时即发生碱基特异性链终止，而引物延伸合成的新链DNA即是待测DNA模板的互补链。2/、3/—ddNTP与dNTP不同之处在于它在脱氧核糖的3/—位置无羟基。它们可在DNA聚合酶作用下通过其5/—三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于缺乏3/—羟基而不能与后续的dNTP形3/ 、5/磷酸二酯键，从而使DNA链的延伸终止。这样，在DNA合成反应混合物的四种dNTP中分别加入少量的一种ddNTP后，链延伸反应将与偶然发生但却十分特异的链终止过程竞争，导致其反应产物为一系列长度不同的核苷酸链，链的长度即从启动DNA合成的引物5/—末端到出现ddNTP而至链延伸终止的位置之间的距离。在四组独立的酶反应中分别采用四种不同的ddNTP，结果将产生四组长度不一的核苷酸链，它们分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每一个C或每一个T的位置。反应中加入一种带有放射性核素（如32P或35S）的底物dNTP，这类具有放射活性的dNTP同样遵循碱基互补配对原则而掺入新合成的模板互补链中。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后对X—光片曝光即可获得长度相差一个核苷酸的DNA链分离图谱。在加入某种ddNTP（如ddATP）的反应产物凝胶电泳图谱中的任何一条区带都代表该核苷酸链的3/—端是以该种ddNTP（如ddATP）结尾，这样就可读出待测模板DNA的核苷酸序列。 4、什么是基因克隆？ 克隆即来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化，即无性繁殖。 基因克隆即重组DNA技术，指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案，采用酶学方法将不同来源的DNA分子在体外剪切和重新连接，组装成一个新的DNA分子。在此基础上，将这个DNA分子导入到一定的宿主细胞，使它能够在宿主细胞中扩增，形成大量的子代分子，此过