细胞热力学工研究方法3.pptVIP

六．定量细胞化学分析技术 （一）细胞显微分光光度术（microspectrophotometry） ?利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质 （如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 （二）流式细胞术（Flow Cytometry） （三）细胞电泳 原理：在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。 各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同 。 用途：检测细胞生理状态、分离不同种类的细胞。 七、利用大分子间的相互作用克隆新的基因 鉴定可与蛋白质结合的DNA序列 分离靶蛋白质，（可采用gel-shift assay) 克隆靶蛋白的表达基因。 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 （一）动物细胞培养 原代培养 （primary culture）：即：培养来自动物机体的细胞群。将细胞转移到新的容器中培养称为传代或传代培养（passage），每代细胞分裂约3-6次。 细胞株（cell strain）：从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制行为。 细胞系（cell line）：原代培养细胞成功传代即为细胞系。染色体明显改变，呈亚二倍体或非整倍体，失去接触抑制行为。 克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 表三、实验室中常用的几种细胞系 （二）植物细胞培养 （一）细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）技术 * * 用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离DNA含量不同的中期染色体。 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。 charge （1）利用DNA与蛋白质间的相互作用 酵母单杂交法 酵母单杂交（yeast one－hybrid system)是一项常用于研究DNA与蛋白之间的相互作用的方法。 特点：通过该方法可以识别稳定结合于DNA上的蛋白质 ，可在酵母细胞内研究真核生物DNA与蛋白之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。 基本原理： 转录激活结构域 （activation domain，AD） DNA结合结构域 （DNA binding domain，BD） 顺式作用元件 报告基因得到表达 激活Pmin启动子 真核生物转录因子基本构件 报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其 表达产物非常容易被鉴定的基因。 作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有 以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在 基本操作过程为: cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合 导入酵母细胞 基因产物 （蛋白质） 顺式作用元件 激活Pmin启动子 报告基因得到表达 筛选阳性克隆 测序分析 cDNA替换了编码结合结构域(BD)蛋白基因 应用领域： 主要用于确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用； 用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能编码基因； 验证反式转录调控因子的DNA结合结构域； 准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。 酵母双杂交系统 酵母双杂交系统（Yeast two－hybrid system）巧妙地利用了真核生物转录调控因子的组件式结构（modular）特征，因为这些蛋白质往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中DNA结合结构域（DNA binding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。单独的BD能与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。 （2）利用蛋白质之间的相互作用 酵母双杂交技术的基本原理 已知蛋白编码基因X 编码BD基因 cDNA不同片段Y 编码AD基因 诱饵 猎物 转化酵母细胞 报告基因 表达 不表达 X与Y编码蛋