大肠杆菌电工转化感受态细胞制备.docVIP

大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天： 1. 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天： 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次） 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时） 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天） 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液 11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12. 离心，弃上清液 13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散） 15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存转化方法:1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟 2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中 4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上） 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养 【实验目的】 1、了解感受态细胞制备与转化的原理 2、掌握感受态细胞制备与转化的操作步骤 3、获得转化有质粒pGEX-NS53的转化菌株 【实验原理】 转化作用是在一定条件下，一种特定的DNA分子（供体或称转化因子）转入到一定的细菌体内（受体菌），使其发生遗传形状改变的过程。 在正常生长条件下，少数细菌可发生转化作用，但大多数细菌并不发生转化，只有在一定条件作用下（如用Ca++处理细菌细胞或电刺激），细菌呈现感受状态后，外源DNA才能转化进入受菌体内。因此，若想将外源DNA分子转化进入一定的受菌体内，通常需将受体菌先制备成易感受状态。 感受态通常指的是细菌具备吸收转化因子的一种生理状态。产生感受态细胞的理论机制目前除有一些假说外，并无统一的结论。一般说来，细菌细胞在对数生长的早中期，经处理后，有一定的转化能力，但在它们进入静止生长期以后，就逐渐丧失。因此进行细菌细胞转化时，掌握合适的细菌培养时机是很重要的。本实验所用的供体DNA分子为一个重组质粒，它是将人庚型肝炎病毒（HGV）NS5区的一段长度为881bp的cDNA片段（NS53）插入到表达载体pGEX-5X-1中，位于编码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶（GST）的下游，并与GST处于同一阅读框。因此在受体菌体内将表达出GST-NS53融合蛋白。实验中所用的受体菌为大肠杆菌BL21（DE3）选择此菌株是因为可用乳糖替代IPTG作为目的基因表达的诱导剂，使实验的进行更为经济。 【实验器材】 超净工作台、HBY恒温摇床、台式高速离心机、恒温培养箱、721分光光度计、高压灭菌锅、灭菌Eppendorf管、试管、微量移液枪、培养皿、灭菌离心管、移液管、涂布棒。 【实验试剂】 1. LB液体培养基 蛋白10g、酵母提取物5g、NaCl10g，溶于950ml双蒸水中，用NaOH调pH至7.0，然后定容为1000ml。15磅20分钟高压灭菌。需加抗菌素时，冷却至50℃以下，加入相应浓度的抗菌素。 2. LB固体培养基 向LB液体培养基中加入2.0%的琼脂粉，15磅20分钟高压灭菌，然后加入适量抗菌素，向每个平板中倒入15-20mlLB固体培养基，凝固后倒置，4℃保存。 3. 转化试剂 CaCl2溶液（lM）：取54g CaCl2·6H2O溶于20ml无菌水中，15磅20分钟灭菌后，分装成小份于4℃保存。 4. 菌株与质粒 大肠杆菌BL21（DE3）[hsdSgal（λcits857indlsam7ni5lacuv5-T7 genel）]。 5. 质粒pGEX-NS53。 【实验方法】 1. 大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞的制备 将一BL21（DE3）单