基因工程研工究策略和实践.pptVIP

基因决定性状 青霉素能产生青霉菌 家蚕能吐出蚕丝为人类利用 定向改造基因的设想 1. 能否让细菌“吐出”蚕丝？ 2. 能否让微生物产生人胰岛素、干扰素等昂贵药物？ 基因工程过程示意图 基因工程的研究策略 一、目的基因的分离( donor DNA ) 二、载体DNA及其改造(Vector DNA) 三、体外DNA重组(DNA recombination ) 四、重组DNA的转化( Transformation) 五、重组体的筛选鉴定与克隆扩增 ( identification clone amplification) 六、目的DNA在受体细胞中的表达(gene expression) 一、目的基因的分离 从cDNA文库中分离目的基因 从基因组DNA文库中分离目的基因 PCR扩增目的基因片段 化学方法人工合成基因 有复制起点，能自主复制； 具有筛选标记，便于重组体的筛选和鉴定； 具有一种或多种限制性内切酶的单一切割位点，并在位点中插入外源基因后，不影响其复制功能； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。 三、体外DNA重组 概念： 不同来源的DNA片段共价连接、通过重新组合构成了具有两个DNA分子遗传信息的新重组体DNA分子的过程。 分类： 粘末端连接 平齐末端连接法 同聚物核苷酸末端法 人工接头连接 T-A克隆 限制性内切酶 ―“分子剪刀” Ⅱ型限制性内切酶，能专一地识别DNA分子上特定的碱基序列并将DNA切断的内切酶。识别序列的特点；(I)专一；(2)常由4–6个碱基组成； (3)具有回文序列 经切割可以生成平头末端或粘性末端。 可以产生相同粘性末端的不同的限制酶称作同尾酶。 DNA连接酶―“分子针线” 连接双链DNA分子中相邻3’- OH和5’-磷酸基之间的磷酸二酯键的形成。 最常用的是T4连接酶，可以连接粘性末端和平头末端。 1. 粘末端连接 （a）目的基因和载体用同一种限制酶切割后连接。载体易自身环化。 用碱性磷酸酶(能除掉DNA-5’端P基团，使5’端带一OH)处理载体，可防止载体自身环化。 （b）目的基因和载体用两种产生粘末端的限制酶切割后连接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆) 4. T-A克隆 1. 基本概念 转化（transformation）：把以质粒为载体构建的重组DNA，在一定条件下引入受体细胞的过程。 转染（transfection）：以噬菌体或病毒构建的重组DNA引入受体细胞的过程。 感染（infection）：病毒或重组病毒DNA进入细胞的过程。 转化子：又称工程菌，即接受了重组DNA的受体菌。 五、重组体筛选、鉴定与克隆扩增 1. 常用筛选/鉴定阳性重组体的方法 平板筛选 插入失活 插入表达 电泳筛选 PCR筛选 核酸杂交 DNA测序 免疫学检测法 3.PCR法筛选 提取重组质粒DNA，用已知的特异引物扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测有无相应电泳带。 菌落原位杂交法筛选 5. DNA测序 测序：确定DNA链上确切的碱基顺序　 方法：对初步筛选的阳性重组子，扩增后抽提质粒，酶切回收片断，进行DNA测序确认。 图10-12 在酵母细胞中，这种蛋白能像在受乙肝病毒侵染的人体细胞中那样，组装成多亚基 的复合物，能诱导产生抗体。这个质粒结构十分稳定，在含甲醇的培养基中培养 200h后仍不会发生改变。将重组菌置于240L发酵罐中，其表达量相当于约9×l06剂疫苗。 基因工程的实践 2. 弥漫性掌跖角化病患者KRT9突变对中间丝网状结构的影响 为了研究其中3个突变（N160S、L167S、A176P）对中间丝网状结构的影响，就要构建N160S、A176P、L167S的表达载体，观察它们在细胞内的定位和动态变化。 从皮肤cDNA文库和患者基因组DNA 中扩增出KRT9的野生型和突变型，将其克隆至pEGFP-N1质粒中，分别转染了Hela细胞和Hacat细胞。 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 2. 平齐末端连接 优点：可连接任何一对DNA 可恢复一个酶切位点或产生一个新酶 切位点 缺点：连接率低 　　　要求连接酶及底物浓度高 GAA　　ＴＴＣ ＣＴＴ　　ＡＡＧ GAAＴＴＣ