第四章细胞破碎和分离技术范例.pptVIP

能溶解膜结构中的脂蛋白，使细胞通透性增加。 1、细胞的处理量 2、细胞壁的强度和结构 3、目标产物对破碎条件的敏感性 4、破碎程度 三、选择破碎方法的依据 适宜的操作条件应有高的产物释放率，低的能耗和便于后步提取这三方面进行权衡 1、简要说明常用的细胞破碎方法、原理及特点？ 作业与思考题 细胞碎片去除和产品纯化同步的方法 四、从发酵液直接分离产物 细胞破碎 目标产物 细胞碎片很小，很难用过滤法除去。 （一）双水相分离技术 1、双水相体系简介 明胶 琼脂（或可溶性淀粉） 1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现 传统的双水相体系是指高聚物双水相体系 憎水程度有所差异 （1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖； （2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者磷酸盐） 2、常用双水相体系 聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性 3、双水相体系分离细胞碎片 目标产物 细胞或细胞碎片 优点：设备简单，容易放大 缺点：规模放大时，成本增加 用PEG1500/NaH2PO4体系从Trichoderma koningii发酵液中分离纯化β-木糖苷酶，该酶主要分配在下相，下相酶活回收率96.3%，纯化倍数33。 （二）膨胀床分离技术 1、膨胀床的定义 （1）固定床：又称填充床，填充的固体物通常呈颗粒状，堆积成一定高度的床层。床层静止不动，流体通过床层进行分离纯化。 （2）流化床：当流体通过床层的速度逐渐提高到某值时，填料颗粒出现松动，颗粒间空隙增大，床层体积出现膨胀，但是颗粒仍逗留在床层内而不被流体带出。床层的这种状态和液体相似称为流化床 （3）膨胀床 稳定的、返混很小的流化床，即所谓的膨胀床,它既能比较容易地让细胞或细胞碎片通过填料层，又能以填充床的模式来吸附目标产物。 （4）膨胀床与固定床的区别 膨胀床的床层上部安装有可调节床层高度的调节器，当料液从床底输入时，床层产生膨胀，高度调节器上升，床层空隙增加，允许菌体细胞或细胞碎片自由通过。因此，膨胀床吸附操作可直接处理菌体发酵液或细胞匀浆液，回收其中的目标产物。 膨胀床吸附技术 节省离心或过滤等处理过程 （5）膨胀床与流化床的区别 流化床的填料和液体在床层内混合程度高，吸附效率低，而膨胀床的填充颗粒基本悬浮于固定的位置，液体的流动与固定床相似，接近平推流，吸附效率高。 2、膨胀床装置 色谱柱 调节柱床高度 保证液体以平推流形式流过柱子 3、膨胀床吸附剂 （1）吸附剂应具备的条件 ①吸附性能好 ②沉降速率高 ③吸附剂要在粒径和密度上有差异 ④有良好孔道结构，不易被污染 （2）常用吸附剂 多糖包埋石英砂，玻璃微球等。 如Streamline介质：在石英砂外表面包裹了一层琼脂糖 物理吸附，化学吸附和离子交换吸附 琼脂糖上的功能基团可以被修饰，提高目标产物的吸附容量 4、膨胀床的操作（5个步骤） （1）平衡：用平衡缓冲液让膨胀床达到平衡，保持一定的膨胀率。 膨胀2倍，吸附性能最好 通过流速控制膨胀率 （2）进料吸附 把目标产物吸附在吸附剂上，让杂质或细胞碎片等固体颗粒流出膨胀床。 （3）洗涤 洗去留在柱内的细胞、细胞碎片和弱吸附性的杂质。 洗涤结束后，改用固定床操作 （4）洗脱 采用固定床操作，将配制好的洗脱液用横流泵从柱上部导入，下部流出，分段收集，并分析检测目标产物的活性峰位置。 （5）柱床的再生和清洗 原因：非特异性吸附污染 试剂：0.5-1mol/L的NaOH（常用） 方法：控制流速，使柱床膨胀5倍，清洗3小时 4、膨胀床的操作（5个步骤） （1）平衡 （2）进料吸附 （3）洗涤 （4）洗脱 （5）柱床再生和清洗 5、膨胀床的应用 纳豆激酶的分离提取 纳豆：大豆经纳豆菌发酵而成 降血压，抗癌 抗氧化，溶血栓 * 第四章 细胞破碎和分离提  取技术 发酵液或培养液 预处理 固液分离（离心或过滤） 固体沉淀：胞内产物 清液：胞外产物 目标产物 目标产物 细胞破碎和细胞碎片分离 本章内容 一、细胞破碎的主要阻力：细胞壁 细胞破碎的主要目的：破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内物质释放出来。 各种微生物细胞壁组成与结构 二、常用细胞破碎技术及原理 （一）机械法 （二）物理法 （三）化学法 （四）生物法 （五）超临界细胞破碎技术 （一）机械法 利用高压、研磨或超声波等手段使细胞受到挤压，剪切和撞击作用 1、珠磨法 2、高压匀浆法 3、超声破碎法 1、珠磨法 珠磨法原理：细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。 注意：破碎时要采取冷却措施 2、高压匀浆法 利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲撞造成细胞破裂 高压匀浆机 进料口 出料