T细胞增殖功能测定.ppt

ELISA测定各类免疫球蛋白 方法 1. 包板：96孔板用浓度为10μg/ml的特异性单抗包被。盖上盖板，37C°，5％CO2，2h，或4C°过夜。常规洗板，封闭。 2. 上样：每孔内加入1:10或1:20 稀释的细胞培养上清液100μl。阳性对照为标准品，阴性对照为培养液。每试验设2复本。室温培育2h，或4C°过夜。 3. 加酶标二抗：每孔加100μl碱性磷酸酶标记的羊抗人IgM或IgG或IgA二抗。室温培育2h，或4C°过夜。 4. 显色：洗板，每孔加100μl底物（p－nitrophenyl phosphate）。 5. 自动酶标仪读数，从标准曲线读出抗体浓度。 B细胞产生抗体能力的测定 ELISA测定各类免疫球蛋白 评价 ELISA法灵敏、简单、快速、特异性高、重复性好，是测定上清和体液中Ig的首选方法。碱性磷酸酶标记的二抗显色明显，不必用碱中止反应，尤其适用于测定体外产生的抗体。 应用实践 ELISA可测定各种体液中的抗体，其结果反映被检个体B细胞功能。测定免疫球蛋白各种亚类的水平有助于鉴定免疫缺陷病。 B细胞产生抗体能力的测定 (二)抗体形成细胞测定 反向溶血空斑形成实验（reversed hemolytic plaque assay，RHPA ） 待检人的PBMC或组织来源的淋巴细胞（如扁桃体、脾细胞等） 待检人的PBMC或组织来源的淋巴细胞（如扁桃体、脾细胞等） SPA致敏的羊红细胞（SPA-SRBC） 抗人Ig抗体 补体 * * * * * * * * * 单向混合淋巴细胞培养 注意点 1. 细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检查细胞活力。 2. 培养液中添加的血清：有的血清可能会刺激或抑制反应。 3. 本底应小于2000 rpm，阳性对照组应大于20000 rpm。 T细胞增殖功能测定 成熟淋巴细胞 转化淋巴细胞 抗原诱导的特异性增殖反应 原理 本试验测定T细胞在体外对某一特定抗原的特异性免疫应答能力。所用抗原可以是初次接触的抗原，也可以是曾经免疫过的抗原。常用的测定回忆反应的抗原有纯化蛋白衍生物（PPD）和破伤风类毒素（TT）。这2种抗原都被常规列入计划免疫接种范畴，成人应该对它们有回忆反应。在某些免疫缺陷病中，对它们的特异性回忆反应可减弱或消失。 T细胞增殖功能测定 抗原性刺激物： 破伤风类毒素 链球菌激酶 纯化蛋白衍生物 白色链球菌 同种异型抗原（HLA) 抗原诱导的特异性增殖反应 方法（以T细胞对破伤风类毒素刺激的增殖反应为例） 1. 分离PBMC和APC，APC用丝裂霉素或放射性核素处理。 2. 96孔板中每孔加入1x105 PBMC和1x104 APC。 3. 每孔中加入系列稀释的破伤风类毒素溶液，不同孔中抗原终浓度分别为0、1、5、10和20μg/ml。每一种浓度设3复本。 4. 37C°，5％CO2，6天。 5. 加3HTdR，继续培养18小时。计数。 T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 结果解释 1. 对于接种过破伤风疫苗者来说，本试验结果呈低反应反映患者对破伤风类毒素特异性应答能力低下或全身免疫缺陷。 2. HIV感染者反应低下反映CD4+T细胞减少导致的免疫缺陷。 T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 注意点 1. 培养液中最好用人AB血清。 2. 此T细胞增殖反应需要APC。如使用纯化T细胞，需加5％～10％自身APC。 T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 应用实践 1. 丝裂原诱导的增殖反应 临床上用于评估T细胞对多克隆刺激剂的增殖能力，反映T细胞基本免疫功能，即T细胞群总体的信息，不能反映个别T细胞克隆的情况 PHA常用于测试人T细胞增殖能力，Con A常用于测试小鼠T细胞增殖能力。 T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 应用实践 2. 单向混合淋巴细胞反应 1）本方法主要用于估计器官移植前供体与受者之间MHC相配程度。 2）如培养时间超过96 小时，可制备细胞毒性T细胞（CTL）。 T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 应用实践 3. 抗原诱导的特异性增殖反应 用于估计机体对特异性抗原的应答能力和机体总体免疫应答能力。 T细胞增殖功能测定 MTT法 四甲基偶氮唑盐（MTT)在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，被还原成黑色的MTT-甲臢，