大肠菌群三步法与两步法的比较要点.pptVIP

大肠菌群经典三步法和LST两步法的比较与评价 第一组 PPT制作：成都中医药大学 PPT演讲：？？？？？ 试验菌种 培养基培养 稀释、混匀待用 设置空白对照 与多个平行 样品制备 检验过程 样品 三步法 两步法 乳糖发酵 平板分离 证实试验 初发酵 复发酵 查MPN检索样品中的总大肠菌群MPN值，统计学方法计算 试验样品 按照不同模拟污染 水平进行人工添加 需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。 以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。 广泛应用于食品卫生工作 样品制备 1.试验样品种类与数量选择 为了模拟大肠菌群在不同样品中生长环境不同，样品组成不同，选用种类不同的样品，如水、食物、化妆品等，食物样品又可分为肉类、乳制品、水产品、淀粉类、蔬果类等，同时避免选择添加了防腐剂的样品。选择合适的种类数与数量，处理前经检验确定无大肠菌群与干扰菌或进行高压蒸汽灭菌。 2.空白试验 在分析工作中，存在着系统误差，包括试剂及用水含有杂质所造成的误差等，为消除这部分影响，提高分析准确度，所以要做空白试验。 样品制备 3.菌株选择 将大肠菌群标准菌株（包括大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌）于培养基中35℃培养24h后混合。 4.菌落计数 用灭菌的磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液比生理盐水（NS）合适。因为PBS在稀释的同时可以保护菌体，调节pH值，而且市面上有成品出售；而NS只是纯粹的稀释液。)进行十倍系列稀释至10-10，用后4个稀释度*用营养琼脂计数。每种浓度吸取1mL加到融化温度46℃的15mL左右营养琼脂培养基中混匀凝固，35摄氏度培养24h，取出进行菌落计数。 （*：赵贵明，边凌淳，应用不同方法检测食品中大肠菌群结果的比较，微生物学杂志，2003年11月 第23卷 第6期） 样品制备 菌落计数流程图 1.选择平均菌落数在30~300之间者进行计算，若只有一个稀释度平均菌落数符合此范围，则将该菌落数乘以稀释倍数报告。 2.若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则取较小数字。 3.若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则报告未检出。 36±1℃ 48±2h 做成几个适当倍数的稀释液 选择2~3个适当稀释度，各以1mL分别加入灭菌平皿内 每皿加入适量的营养琼脂 菌落计数 报告 检样 样品制备 5.试验样品制备 按照不同样品类别分别按规定加入磷酸缓冲液处理，每份样品分高、中、低三个水平进行菌悬液人工添加，高度污染为添加600-1200CFU/g，中度污染添加120-600CFU/g，低度污染添加30-120CFU/g，以保证样品含菌数量在检测范围内。同时用相同样品做三份平行试验与一份空白试验。均质后，-18℃保存备用，试验前用无菌磷酸缓冲液稀释至10-3。 检验方法：三步法与两步法 三步法： 水样接种到双料乳糖蛋白胨培养液中培养 产酸产气的发酵管转种在伊红美蓝琼脂平板上培养 挑选可疑菌落染色、镜检、证实试验 乳糖发酵试验 分离培养 证实试验 两步法： 接种月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤培养 从产气的LST肉汤管中取培养物移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中培养 初发酵试验 复发酵试验 三步法所用培养基及其作用 乳糖蛋白胨培养液 蛋白胨………………………提供碳源和氮源满足细菌生长的需求 牛肉膏………………………提供碳源 乳糖…………………………大肠菌群可分解的糖类 氯化钠………………………可维持均衡的渗透压 溴甲酚紫乙醇溶液…………产酸指示剂 蒸馏水………………………溶剂 伊红美蓝培养基 蛋白胨………………………提供碳源和氮源满足细菌生长的需求 乳糖…………………………大肠菌群可分解的糖类 磷酸氢二钾…………………中和过量酸 琼脂…………………………培养基固化剂 蒸馏水………………………溶剂 伊红水溶液…………………大肠菌群特异性指示剂 美蓝水溶液…………………大肠菌群特异性指示剂 两步法所用培养基及其作用 月桂基硫酸