第二章基因工程概论解决方案.ppt

RF DNA M13噬菌体 （二） M13噬菌体性质 ①在IS区内插入LacZ基因 ②在标记基因区内组装MCS区段 柯斯质粒 ※柯斯质粒载体，又称粘粒、柯斯载体，是一类人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是cos site carrying plasmid的缩写。 柯斯质粒pHC79 　系由质粒pBR322和噬菌体λ的cos位点的一段DNA构成全长4.3kb Cosmid载体的特点 　①具有λ噬菌体的特性 　②具有质粒载体的特性 　③高容量的克隆能力 采用柯斯质粒作载体的不足 ①载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。 采用柯斯质粒作载体的不足 ②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析 采用柯斯质粒作载体的不足 ③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。 第四节　人工染色体克隆载体 ※人工染色体指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统。 温和性病毒： 溶原性增殖→构建病毒载体 烈性病毒： 溶菌性增殖→改造后构建病毒载体 酵母人工染色体（YAC） 酵母人工染色体（YAC)是人工染色体中能克隆最大DNA片段的载体，可以插入100-2000kb的外源DNA片段。 有酵母的自主复制序列、着丝点、四膜虫的端粒以及酵母选择性标记组成的酵母线性克隆载体。 pYAC4人工染色体 优点： 　可以容纳更长的DNA片段，用较少的克隆就可以包含特定的基因组全部序列，从而保持了基因组特定序列的完整性，有利于物理图谱的制作。 　例如，某些基因如人凝血因子VII基因长达180kb，肌营养不良基因大于1800 kb． 缺点： （1）克隆外源基因易出现嵌合体 （2）有些克隆不稳定 （3）YAC克隆不容易与酵母自身染色体相分离 细菌人工染色体（BAC） 细菌人工染色体（BAC）是以细菌F因子为基础构建的细菌克隆载体。 BAC克隆容量可以达300kb ，可以通过电穿孔导入细菌细胞。 拷贝数低，稳定，比YAC易分离。 第二节　大肠杆菌质粒载体 二、pUC质粒载体 ※1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322和M13基础上构建的 优点 ①具有更小的分子量和更高的拷贝数 ②适用于组织化学法检测重组体 ③具有多克隆位点区段（MCS） 第二节　大肠杆菌质粒载体 三、pGEM系列载体 ※由pUC派生而来 ※与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6 特点 ①如果加入纯化的T7或SP6 RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA ②外源基因正接反接都可以转录 ③MCS与pUC18的完全一样 第三节　病毒（噬菌体）载体 ※病毒基本结构： DNA（或RNA）+ 外壳蛋白 　感染细菌的病毒，称为噬菌体。 第三节　病毒（噬菌体）载体 ※分类（根据病毒与宿主关系）： 温和性病毒： 溶原性增殖→构建病毒载体 烈性病毒： 溶菌性增殖→改造后构建病毒载体 ※噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期，只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。 烈性噬菌体溶菌生长的基本过程： 1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来 噬菌体的溶源生命周期： 溶源生长周期： 　是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。 现知只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期 λ噬菌体 （一） λ噬菌体性质 ①组成： λDNA + 外壳蛋白 λDNA (48.5kb) 噬菌体中：线性 宿主细胞：环状(cos位点) λ噬菌体 （一） λ噬菌体性质 ②是一个温和噬菌体 一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。 λ噬菌体 （一） λ噬菌体性质 ③复制 溶源周期随溶源细菌染色体一起复制 溶菌周期的早期是“θ”复制，晚期进行滚环复制 λ噬菌体 （一） λ噬菌体性质 ④基因组成 λDNA至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排列 其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1／3为非必须区段 λ噬菌体 （二） λ噬菌体载体的构建依据 1、λ噬