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特殊显微镜的使用 暗视野显微镜 原理： 暗视野显微镜在构造上应用了丁达尔现象，在聚光镜中央有挡光片，不能直接观察到照明光线，只允许被标本反射和衍射的光线进入视野，因而视野的背景是黑的，物理的边缘是亮点。 视场内被斜射光线照明，即通过样品各种结构表面散射和反射光线，看到许多细胞器的明亮轮廓，如细胞核、线粒体和液泡等。 优点：分辨率比普通显微镜高50倍。 缺点：不能辨别细微结构。 应用：在某些细菌、细菌等活体检查中常常使用暗视野显微镜。 常用的暗视野照明法： 中心遮光法 暗视野聚光法 相差显微镜 光的三要素： 波长、振幅、相位 20世纪30年代初，德国物理学家泽尼克（Zernike）根据“相衬法”原理，于1932年制造出了世界上第一台相差显微镜，并因此获得1953年的诺贝尔物理学奖。 相差显微镜 1 原理： 当照明光线通过活细胞时，虽然波长及振幅没有明显的变化，但由于细胞的各部分及细胞与周围介质之间折射率有所差别，光波透过后可产生相位的变化。 光线通过各种界面时，一部分仍为相位和振幅相同的直射光，另一部分由于光的衍射现象而向周围发散成衍射光。衍射光与 直射光的波长一致，但相位不同。 一般衍射光的相位比直射光推迟约1/4λ，同时到达一点时，两者相互干涉，形成合成光，其强度取决于两光波的振幅和相位差。 在相差显微镜中，通过相板和环状光阑改变衍射光或直射光的相位，将直射光和衍射光的相位差变成振幅差。 如果推迟直射光的相位1/4λ，则直射光和衍射光的相位相同，发生相长干涉，合成光有2倍的振幅，样品最为明亮，称复反差。 如果推迟衍射光的相位1/4λ，则直射光比衍射光超前1/2λ，这时发生相消干涉，即波峰与波谷相遇，合成光比直射光暗，成正反差。 一般生物样品中各种结构推迟光程的能力不同，但都在上述两个极端之间，这样就会出现明暗程度的不同。 步骤： 1、相差显微镜的调试 （1）光路调中：光路中心和照明光束的中心合一、聚光器调中的步骤为： 1，把聚光镜调到最高位置； 2，开启光源； 3，转动转盘，使“O”进入标示孔； 4，低倍镜聚焦样品； 5，缩小视野光阑，在显微镜的视野里可见视场光阑的模糊图像； 6，微降调聚光器使视场光阑的像清晰。 7，双手调节聚光器的两个调中螺杆，使视场中心移至视野中央。 8，开放视场光阑，使其周边与视野周边相接，形成视野的内接多边形，如不能内接，则重复步骤7和8 9，使聚光器升至顶点，光路调中即告完成。 2，插入合轴调整望远镜，转动望远镜上面的螺旋，使其升降（不要从目镜筒中拔出望远镜），至两环清晰为止。 3，双手轻按转环状光阑调中螺杆并转动，使环状光阑移到环状光阑与相板共轭面完全重合为止。 4，如果环状光阑的大小与相板的大小不完全一致，升降聚光器，使之一致。 5，拔出望远镜，换入目镜后即可开始做镜检观察，环状光阑也应做相应转换。 荧光显微镜 原理： 荧光显微镜与普通光学显微镜可以共用一些部件（如机架等） 荧光显微镜是利用一定波长的光(通常是紫外光或蓝紫光)激发显微镜下标本内的荧光物质，使之发出荧光，呈现荧光影像。荧光显微镜包括光源、滤片系统和显微镜三个部分。 * （2）合轴调节 在设计上，相差显微镜的共轭面的直径和宽度与环状光阑与相板共轭面的透光环是一致的，使用时，每一相差显微镜必与环状光阑相匹配，还要调节两环，使其合轴。 调节方法： 1，从目镜筒中拔出目镜； 两种不同类型的光学显微镜所拍摄的图像比较 荧光显微镜 在光镜水平上，借助于标记荧光素或激发荧光，对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类等组分进行定性定位观察。 激发光源 滤光片系统: 核心部件：专用的物镜镜头和滤光片系统 激发滤光片（安装在光源和样品之间，只允许特定波长 的激光通过） 阻断滤光片（安装在物镜和目镜之间，只容许荧光染料 所发出的荧光通过） 荧光染料DAPI特异性结合细胞中DNA GFP蛋白与编码蛋白基因融合 荧光素直接标记技术和免疫荧光技术 * * * 荧光，是一种冷发光现象，当某种物质经某种波长的入射光照射，吸收光能后进入激发态，并立即退激发发出比入射光波长长的出射光；即荧光，当停止照射，发光现象也随机消失。 荧光素直接标记，如罗丹明，FITC，DAPI