第三章酶蛋白的化学修饰解决方案.ppt

第三章 酶蛋白的修饰 概述 酶分子修饰： 　通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的某些的特性和功能的技术过程。 作用： 　提高酶的活力；增强酶的稳定性；降低或消除酶的抗原性；研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响。 方法： 　酶分子的主链修饰、侧链基团修饰、组成单位置换修饰、金属离子置换修饰、物理修饰等。 第一节 酶的化学修饰 从广义上来说，凡通过化学基团的引入或除去使酶的共价结构发生改变，都称为酶的化学修饰 影响酶蛋白化学修饰反应进程的因素主要有两个：1.酶蛋白功能基的反应性；2.修饰剂的反应性。 影响酶蛋白功能基反应性的因素 1.微区的极性 2.氢键效应 3.静电效应 4.位阻效应 蛋白质功能基的超反应性：蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常迅速的反应 影响超反应性的因素 改变蛋白质功能基的pK值 蛋白质功能基具有较大的亲核性 通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当取向 试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学适应性 试剂的结合等 二、修饰剂反应性的决定因素 选择吸附 修饰剂根据各自的特点选择性地吸附在低或高极性区 静电相互作用 带电的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的部位 位阻因素 蛋白质表面的位阻因素或者底物、辅因子、抑制剂所产生的位阻因素都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应 催化因素 修饰部位的其他功能基如果起一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应 局部环境的极性 有些有机反应的速度与溶剂的极性有关 酶化学修饰的局限性 某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链是绝对专一的化学修饰剂 化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释 酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，但是X-射线衍射结构分析结果表明，其他氨基酸侧链在维持酶的空间构象方面也有重要作用，而且从种属差异的比较分析，它们在进化中是比较保守的。目前还不能用化学修饰的方法研究这些氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用 酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性“必需”的，为什么是必需的，还得用X-射线和其他方法来确定，因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性 第二节　酶分子的主链修饰 利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 作用： 提高酶的催化活性 降低或消除酶的抗原性 确认酶活性中心在主链上的位置 了解主链的不同位置对酶的催化功能的贡献 一、主链的切断修饰 酶分子的主链包括肽链和核苷酸链，主链被切断后，可能出现下列三种情况： 酶活性中心被破坏，丧失催化功能，用于探测酶活性中心的位置 仍维持酶活性中心的空间构象，保持催化功能，但抗原性等特性发生改变，可以提高某些酶（尤其是药用酶）的使用价值。 　　　例如：肽链有限水解修饰：采用适当的方法使酶分子的肽链在特定的位点断裂，其分子质量减少，可以在基本保持酶活力的同时使酶的抗原性降低或消失。 有利于酶活性中心的形成，可使酶分子显示其催化功能或使酶活力提高。 　　　例如：生物合成的不显示催化活性的酶原，经过适当的修饰，可以转化为具有催化活性的酶 主链的切断修饰通常使用某些专一性较高的酶作为修饰剂，也可采用其它方法使酶的主链部分水解。 二、主链的连接修饰 将两种或两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有两种或者多种催化活性的修饰方法 在一个酶分子上具有两种或者多种催化活性的酶称为多酶融合体 多酶融合体往往是基因融合的产物，通过基因融合技术将两种或两种以上的酶的基因融合在一起形成融合基因，再经过克隆和表达，有可能获得各种多酶融合体 第三节　酶的侧链基团修饰 采用一定的方法（一般为化学方法）使酶的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法 作用： 酶学方面：研究酶分子的结构和功能，如：了解酶分子的构象，研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响，研究酶的活性中心中的必需基团，测定某一种基团在酶分子中的数量 酶工程方面：提高酶的活力、增加酶的稳定性、降低酶的抗原性，引起酶催化特性和催化功能的改变，提高酶的使用价值，还可能获得自然界原来不存在的新酶种 侧链基团修饰方法 酶有蛋白类酶和核酸类酶两大类，它们的侧链基团不同，修饰方法也有所区别。 酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团，酶RNA的侧链基团是指组成RNA的核苷酸残基上的功能团。 酶的侧链基团修饰方法很多，主要有：氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰、胍基修饰、酚基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰、分子内交联修饰、大分子结合修饰等。 一、氨基