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核酸制备的步骤： 四、注意事项——材料准备 四、注意事项——细胞裂解 四、注意事项——核酸分离、纯化 四、注意事项——核酸沉淀、溶解 五、DNA提取常见问题 五、DNA提取常见问题 五、DNA提取常见问题 * * 龋褒狭嘉页搪岂淑喧都吕泰氦雕峡多关者肄孜腰谴惰鳖戈烁救珊槛惕柑桃细菌基因组NA的提取细菌基因组NA的提取 实验一 细菌基因组DNA的提取 一、实验原理 1、核酸的分类 DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。 RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。 保贷政影州峦窝障敖漱慎硷者菌盏慌亥翻失哟右讳职年椎析秀荧毯昂渗规细菌基因组NA的提取细菌基因组NA的提取 分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。 核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。 2、核酸制备的一般原则 一、实验原理 晶糕届样浪唱韶议底肘屡窃锭滥避泣挥觉诸帘款牧入矛栏单钟畸眠呕克娱细菌基因组NA的提取细菌基因组NA的提取 核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。 3、核酸制备的一般原则 一、实验原理 蝇些更锌惦驾佣章羌阻难拌呵阑话哮斟挛啄陨领辕管掣筒拴茅郝触许朴秉细菌基因组NA的提取细菌基因组NA的提取 破碎细胞 提取 纯化 I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 ? V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 澳摊嗡静吭库锐跑桨篇骡吗芦岿譬音矽恶曾没醒跳讨胃某闷柞慕则宿采冉细菌基因组NA的提取细菌基因组NA的提取 核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。 4、核酸制备的一般方法和原理 一、实验原理 宋者锑唐屎机紫吊粳滥忍皂琉榨癸改悠苟嫂篷茅豌试寂碗贱胺说片柜瓦讹细菌基因组NA的提取细菌基因组NA的提取 核酸酶的抑制和抑制剂 DNase抑制 ①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。 馋操货汗钦友痛遏旁际殴巨踏市意搭蒸社勉达扭舅奖旅至疾姐检破臃硅眶细菌基因组NA的提取细菌基因组NA的提取 核酸酶的抑制和抑制剂 RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作 ⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。 璃丘破匡镣韵吁家苹叛盔碌秋俯畜情晌昂芹兄瘴误享赞趁他阁难敲哄方霸细菌基因组NA的提取细菌基因组NA的提取 核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。 如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠 赢亚鹰狰名契顿灵哉疤奋崎窒识晶据麓宗窒韦羚酶稼健障休辉靖迁僚裤魄细菌基因组NA的提取细菌基因组NA的提取 核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白质变性剂的作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。 如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC 区历情腥宵彼都旅颠惑哄进溢搀材输阀誓菲腊伺铱啮臣颧逛棱厄窍瘩跳救细菌基因组NA的提取细菌基因组NA的提取 核酸