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第十三节　基因工程药物制造实例 干扰素是真核细胞对各种刺激作出反应而自然形成的一组复杂的蛋白质。 干扰素除具有广谱抗病毒活性，还具有抑制细胞分裂，特别是抑制肿瘤细胞生长和免疫调节等功能，作为一种生物活性蛋白有着良好的临床应用价值。 干扰素是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素在分为α1b、α2a、α2b等亚型，其区别仅表现为个别氨基酸。 是我国已经批准上市的基因工程药物。 早期获得方法：用病毒诱导人白血球(白细胞)产生，产量低，价格贵。300L人血才提取1mg 。 一、基因工程菌的组建 诱生的白细胞 提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱 蔗糖密度梯度 获得寡A的mRNA 离心提取12s 的 mRNA 逆转录成cDNA 双链cDNA接上dT或dG尾 pBR322质粒 pBR322质粒加上dA或dC 退火获的杂交质粒 转化大肠杆菌k12 扩增杂交质粒 筛选抗四环素但对氨苄 用已知干扰素的DNA片断作为 青霉素敏感细菌克隆 探针挑选富有干扰素cDNA克隆 将干扰素cDNA克隆入表达载体 在大肠杆菌 中进行高效表达 二、基因工程干扰素的制备 启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提 精提 半成品制备 半成品检定 分装 冻干 成品检定 成品包装 α2b干扰素生产过程 1.发酵 工程菌：SW-IFNα-2b/E.coli DH5α，质粒用PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因。种子培养基含1%蛋白胨0.5%酵母提取物0.5%NaCl。制备种子液作为发酵罐种子使用。 发酵培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.05%NaCl，0.01%NH4Cl等。发酵培养基加入氨苄青霉素，防泡剂。30℃发酵8h，然后在42℃诱导2-3h可完成发酵。每隔不同的时间取发酵液，离心称量湿菌体。 2.产品的提取与纯化 a冷却后离心，除上清液，得湿菌体悬浮于缓冲液中，冰浴条件下超声破碎； b离心，取沉淀部分；加尿素、缓冲液和二巯基苏糖醇溶液溶解。搅拌抽提2h，离心取上清。 c加入复性缓冲液，离心，除去不溶物。 d超滤器浓缩后，经Sephadex G50 分离。 e经SDS检查。 f再经DE-52柱纯化。 三、质量控制标准和要求 ⒈半成品检定 ⑴干扰素效价测定 ⑵蛋白质含量测定 ⑶比活性 ⑷纯度测定 ⑸相对分子量测定 ⑹残余外源性DNA含量测定 ⑺残余血清IgG含量测定 ⑻残余抗生素活性测定 ⑼紫外光谱扫描 ⑽肽图测定 ⑾等电点测定 ⑿除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验、热原试验。 ⒉成品检定 ⑴物理性状 ⑵鉴别试验 ⑶水分测定 ⑷无菌试验 ⑸热原试验 ⑹干扰素效价测定 ⑺安全试验 一章回顾 基因工程技术： 在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。 质粒的结构不稳定 包含体 是无定形的蛋白质的聚集,不被任何膜所包围，重组蛋白在大肠杆菌中的高表达水平经常导致蛋白聚集而形成不溶、无活性的包含体。 如何获得目的基因 基因表达的宿主菌有哪些？ 真核基因在大肠杆菌中表达的形式? 酵母细胞作为宿主细胞相对大肠杆菌来说有那些优点？ 制备基因工程药物的宿主应该满足那些条件？ 制备基因工程药物的基本过程 质粒不稳定的原因？ 酵母细胞作为宿主细胞相对大肠杆菌来说有那些优点？ 基因工程菌应该满足那些条件？ 容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；容易进行代谢调控；容易进行DNA重组技术操作； 产物的产量、产率高; 产物容易提取纯化。 制备基因工程药物的基本过程 获得目的基因 组建重组质粒 构建工程菌 （或