第四章基因工程..Convertor要点.doc

第四章 基因工程 基因工程(gene engineering)：又称为重组DNA技术，是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。 分子克隆(molecular cloning)：是指在体外将制备的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝的技术。 第一节 工具酶(限制性核酸酶内切酶；DNA聚合酶；DNA连接酶；碱性磷酸酶；核酸酶S1) 一、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE) 限制性核酸内切酶(RE)是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。 限制酶主要来自于细菌，其切割序列明确，目前商品化的限制酶现有100多种。 命名：Hin dⅢ Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。 三种限制性核酸内切酶的作用： 作用 I II III 酶活性 核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶、DNA解旋酶 核酸内切酶 核酸内切酶、甲基化酶 DN链上的特异识别位点 无 有 有 DN链上的特异切割位点 无 在识别序列内 在识别序列外 在分子克隆中的重要意义 无 有 无 Ⅱ类酶识别序列特点---回文结构(palindrome) ---------GGATCC--------- ---------CCTAGG--------- 切口 ：平端切口、粘端切口 限制性核酸内切酶的主要用途： ①在分子克隆过程中切割DNA以获取目的基因片段、切割载体形成切口，使目的基因能插入载体。 ②分析限制性片段长度多态性(RFLP)，用于遗传病的诊断，法医DNA指纹分析等。 ③用于构建DNA的物理图谱、基因定位及DNA同源性分析等。 二、DNA聚合酶 DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段；Taq DNA聚合酶；逆转录酶；末端脱氧核糖核苷酰转移酶。 ⑴DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段： DNA-polⅠ是单一肽链的多功能酶，分子量为103kd，它具有3种酶活性：①5，→3，聚合酶活性；②3，→5，核酸外切酶活性；③5，→3，核酸外切酶活性。 用特异的蛋白酶可将DNA-polⅠ水解成小片段和大片段，后者为Klenow片段。 Klenow片段的主要功能有：①补齐双链DNA的3，末端，同时可使3，末端DNA标记同位素；②在cDNA克隆中，合成cDNA第二链；③DNA序列分析。 ⑵Taq DNA聚合酶：是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65 kd，最佳作用温度是70-80℃，Taq酶具有5，→3，聚合酶活性和依赖于聚合作用的5，→3，外切酶活性。 Taq DNA聚合酶可用于DNA测序及通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增。 ⑶逆转录酶：是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板、4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录作用。 逆转录酶的功能：①逆转录作用；②核酸酶H的水解作用；③依赖DNA的DNA聚合酶作用。 ⑷末端脱氧核糖核苷酰转移酶： 末端脱氧核糖核苷酰转移酶简称末端转移酶，分子量为60kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3，末端-OH上。底物是单链DNA或有3，突出末端的双链DNA，需要Mg2+参与；底物是平端或3，凹端的双链DNA，需要Co2+。 末端转移酶的功能主要有： ①在载体或目的基因3，末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。 ②用于DNA 3，末端的同位素探针标记。 三、DNA连接酶 DNA连接酶包括大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶两种类型，分子量分别为7500和6000，两者的辅基不同，前者需NAD+，后者需ATP。它们催化的反应也不尽相同，大肠杆菌DNA连接酶只能连接粘性末端，而T4 DNA连接酶既能连接粘性末端，又能连接平末端。 四、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5，-磷酸基团，其主要用途有： ①除去DNA片段上的5，磷酸，以防自身连接。 ②在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，除去RNA或DNA上5，端的磷酸。 五、核酸酶S1 核酸酶S1可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分，其主要作用是 除去粘性末端以产生平末端、除去cDNA合成时形成的发夹结构以及分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况。 功能：水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体中的单链部分。 核酸酶S1