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单克隆抗体技术 实验目的 了解单克隆抗体的制备过程 实验原理 根据肿瘤细胞可以无限增殖、B细胞可以分泌抗体的特点将他们在体外融合，通过一定的筛选方法得到既可以分泌特异抗体，又可以无限增殖的融合细胞。 一、抗体分泌细胞的分离 1.以抗原常规免疫小鼠，回收血清作为阳性对照。 2.取小鼠脾脏，研磨，过滤，使成单个细胞。 3.用淋巴细胞分离液分离B细胞。 将14％Ficoll400与 33％的泛影葡胺，混匀。取6ml加于离心管底部，然后在其顶部轻轻加上脾细胞悬液，2000rpm离心20分钟，使形成液体界面。 吸取界面上的脾细胞制成脾细胞悬液，存于4℃冰箱备用。 二、细胞融合 肿瘤细胞融合前24h换液一次，培养至对数生长期，收集，洗涤，存于无血清培养基。 无菌条件下融合，置于完全培养基，过夜，重新悬于HAT培养基，接种，培养。 三、特异抗体分泌的检测 取纯化抗原制成适当浓度，加于96孔板底，4℃冰箱过夜。PBS清洗2－3次。 加入0.5％戊二醛溶液，室温反应15分钟。PBS清洗2－3次。 加入5％的脱酯奶粉，室温封闭30分钟，PBS洗一次，弃去液体。 取待检测抗体，按两板孔的对应位置逐孔加入50μl，37℃水浴60分钟。TP液洗3次后。 加入HPR标记的二抗液，于37℃水浴1小时。 加入底物液各100μl，于37℃反应30－60分钟。 酶标仪读数分析，与阳性血清对照，确定阳性分泌的克隆孔。 四、阳性孔进一步单克隆化 混匀阳性孔细胞再次接种96孔板，培养15－20天。Elisa法确定阳性孔后进一步单克隆化。 收集阳性孔细胞，悬浮于HT培养基中，计数细胞，稀释至0.8个cell/孔。接种于新的96孔板，再用Elisa法检测阳性的孔，可认为是单克隆化的杂交瘤细胞。 培养后移入24孔板进行扩增。酶标仪上检测抗体分泌仍为阳性的细胞冻存。 以避免无关细胞克隆过度生长。有些克隆在低细胞密度时生长较差，此时加适量的饲养细胞、使用高质量的胎牛血清可能有帮助。在克隆化过程中，应保留所有可能有意义的细胞，以便作进一步的克隆化和检查，避免杂交瘤细胞的丢失。 初期的杂交瘤细胞不稳定，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 饲养细胞 在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞， * * 细胞融合技术： B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 不分泌抗体 长命 分泌抗体 短命 分泌抗体 长命 K?hler和Milstein, 1975 1984年Nobel医学奖 杂交瘤细胞的筛选 ： B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 脾细胞/?脾细胞 骨髓瘤细胞/ ?骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞 脾细胞 筛选出 不能长期存活 不能长期存活 HAT培养基筛选 H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶 DNA 内源性途径(主要途径) 谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸 二氢叶酸还原酶 A H T 外源性途径(旁路途径) (Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase) 次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT ) 胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase) B淋巴细胞： HGPRT + ， TK+ 骨髓瘤细胞： HGPRT - ， TK- 存活 死亡 外源性途径(旁路途径) 培养上清中X抗体的检测 克隆化培养 单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测 杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体 规模化培养 获得大量单克隆抗体 动物免疫 细胞融合 混合细胞的HAT筛选) 分泌X抗体 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 X抗原 B淋巴细胞 瘤的突变株 培养数天后细胞死亡 无限生长细胞 分泌 X抗体 只有杂交瘤细胞可长期存活下来 BALB/c 杂交瘤技术操作流程图解 酶联免疫吸附法(ELISA) 抗原 第1抗体 酶 第2抗体 待检杂交瘤培养上清液 底物 有色产物 酶标仪检测 技术原理： (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 克隆化应尽早进行并反复筛选 由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对于一个抗原决定簇——单克隆抗体(monoclonal antibody, MAb) 单克隆抗体(monoclonal antibody, MAb) 单克