1摘要核桃,系胡桃科核桃属植物.docVIP

克隆平末端的目的片段时，为最大量地获得“正确”的连接产物，载体和目的DNA在连接反应中的比例必须适当。载体与目的DNA的摩尔比过高，会造成大量的环化空质粒，既可能是单一质粒的环化，也可能是多个质粒聚集而形成的环化。摩尔比如果过低，则会产生过量的在大小、方向和组成上各不相同的线状和环状的均质或异质性多聚体。为此，每一重组体中外源DNA的连接方向和插入数量都必须用限制酶酶切图谱分析或其他方法加以鉴定。本实验以载体与目的片段的摩尔比为1:10进行连接，同时应用三种不同的限制性内切酶进行多重鉴定，取得了满意的实验结果。??? 连接体系中高浓度的平端，也是获得平端连接的必要条件。在载体和目的片段的摩尔比适当的条件下，尽量加大各自的摩尔浓度，以缩小载体片段末端与目的片段末端在空间上的距离，从而加大二者的碰撞几率，减小载体片段的自身环化连接。本实验主要从以下几点来加大连接体系中载体片段和目的片段的平端浓度：1）提取质粒DNA时尽量做到高浓度、高质量；2）酶切时，在不影响酶切效果的情况下，加大酶切体系中质粒DNA的浓度；3）凝胶电泳分离目的DNA时，加入大量酶切产物，胶回收时尽量少带胶，切下的胶中目的片段的浓度尽量高，从而使回收的溶液中DNA片段的浓度尽量高；4）连接体系尽可能小（一般 5~10μl），体系中除T4噬菌体DNA连接酶和相应的缓冲液外，全部由两种胶回收溶液按特定比例填充。???