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Monitoring the Expression Pattern of 1300 Arabidopsis Genes under Drought and Cold Stresses by Using a Full-Length cDNA Microarray The Plant Cell, Vol.13, 61-72, January 2001 Motoaki Seki, Mari Narusaka, Hiroshi Abe, Mie Kasuga, Kazuko Yamaguchi-Shinozaki, Piero Carninci, Yoshihide Hayashizaki, and Kazuo Shinozaki 環境ストレスについて 植物の成長は環境ストレスに影響を受ける。 　　→植物はこれらのストレスに応答し、適応している。 その中でも乾燥?水不足は、植物の成長?作物の生産に最も厳しい制限要因となる。 　　→乾燥ストレスは様々な生化学反応や 　　　　生理学反応を誘導する。 　　 　　例えば、光合成には水が必要であり、また気孔が閉じることにより、 　　ガス交換が妨げられるため、水不足は光合成能力を制限する要因となる。 環境ストレスに対する応答 タンパク質は色々な機能を持っており、状況に応じて合成され、機能している。→何が関わっているのか？ ストレス誘導性の遺伝子が転写されることで、　それに対応するタンパク質が合成され、　　　　　ストレス耐性が向上する。 この研究では、新たなストレス誘導性の遺伝子を同定することを目的とした。 研究の背景 プロジェクトによって、多くの生物の塩基配列などが決定されている。 シロイヌナズナでは2000年の終わりに、全塩基配列が決定された。 今後は、これらのデータベースをもとに機能解析を行うことが重要である。 マイクロアレイについて 近年、遺伝子発現の解析にとって便利な方法として注目されている。 大多数の遺伝子発現の比較解析ができる。 (右図を参照) 目的とした遺伝子 乾燥誘導性遺伝子 (drought-inducible gene) 低温誘導性遺伝子 (cold-inducible gene) DREB1Aの標的遺伝子 (target gene of DREB1A ) 　　DREB1A???DRE結合性タンパク質1A。低温に誘導される。 　　標的遺伝子???ある遺伝子によって発現調節を受ける遺伝子。 植物材料とストレス処理 シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana) ２２℃、３週間、発芽培地上で生育。 乾燥処理 　　　温度２２℃、湿度60%、薄暗い 低温処理 　　　温度２２℃→４℃、薄暗い 　　それぞれの処理は2時間、10時間行った。 トランスジェニック(遺伝子導入)植物 生育条件は先程と同様　(22℃、3週間、発芽倍地上で生育) DREB1A遺伝子を過剰発現させた。 　→つまり、その標的遺伝子の発現量も多くなっていると考えられる。 マイクロアレイ解析の流れ それぞれのRNAを抽出 抽出したRNAを蛍光標識でラベリング 　　　(未処理をCy5〈緑〉、処理をCy3〈赤〉) ハイブリダイゼーション 　　　ラベリングして得られたプローブをチップ上にスポットしてあるcDNA(PCRの生成物)とハイブリダイゼーションをさせる。 チップをスキャナで取り込み、蛍光のパターンを見て、発現量を解析する。 スキャニング後の解析の例 赤→処理したほうが発現量が多い。 黄→処理と未処理で発現量に変化はない。 緑→未処理のほうが発現量が多い。 黒→処理、未処理ともに発現していない。 RNAゲルブロット解析 Northern blot 法を用いて、　　　　　　　　　　　　抽出した全RNAの一部を解析。 　　　　　→マイクロアレイの正確性を評価するため。 調べたい遺伝子に結合する相補的な配列を持ったDNAあるいはRNAプローブ液(今回はPCRで生成されたcDNA)を加えてハイブリダイゼーションを行うことにより、特定のRNAを検出する方法。 マイクロアレイの正確性(RNAゲルブロット解析) マイクロアレイのデータは、RNAゲルブロット解析においても妥当性が認められた。 マイクロアレイで新たに確認された　　　　6つのDREB1A標的遺伝子の発現は、　　　　乾燥?低温に誘導されており、無ストレス処理のトランスジェニック植物においても、過剰に発現していた。 マイクロアレイで確認された遺伝子の数 遺伝子の発現特性によるグループ分け グループに分けられなかった遺伝子―21 新たに確認された遺伝子の同定 相同性検索(BLAST)を利用して、　　　　　　　　新しく確