《植物生物技术概论》2幻灯片.pptVIP

反应初期，目的DNA片段呈指数形式增加；随着目的DNA的积累，在引物、模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和平台期（25个循环）。 * 园艺植物生物工程研究所 1. 双链DNA变性 * （一）PCR的反应过程 园艺植物生物工程研究所 * 2. 引物与模板DNA退火 园艺植物生物工程研究所 * 3.引物延伸 DNA合成 园艺植物生物工程研究所 * 4.第二轮循环的变性 园艺植物生物工程研究所 * 5.第二轮循环的引物延伸 DNA合成 园艺植物生物工程研究所 * 园艺植物生物工程研究所 * PCR反应的特点 特异性强 灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(mg=10-6)水平 简便、快速：PCR反应一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。 园艺植物生物工程研究所 * （二）RT-PCR（reverse transcription PCR） 反转录PCR是一种从RNA扩增cDNA的方法。 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA；再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 园艺植物生物工程研究所 * * 四 DNA片段的化学合成 利用DNA合成仪，根据待合成的DNA片段预定的核苷酸序列，可自动的将4种核苷酸单体按3’-5’磷酸酯键连接成寡核苷酸片段。 合成引物 合成DNA寡核苷酸连杆(linker) 合成基因片段 园艺植物生物工程研究所 寡核苷酸连杆 也称为衔接物或接头，是一种按预先设计，化学合成的寡核苷酸片段。 有一种或几种限制性内切核酸酶的识别序列，使连接了寡核苷酸连杆的DNA片段经过这些限制性内切核酸酶酶切后，可以产生一定的黏性末端，便于与具有相同黏性末端的另一DNA片段连接。 * 园艺植物生物工程研究所 有的寡核苷酸连杆超过100个核苷酸，其上有多种限制性内切核酸酶识别序列，不仅可作为连杆，而且被组装在克隆载体上成为多克隆位点(MCS)。这样的连杆被称为多克隆位点核苷酸连杆或简称MCS连杆。 * 园艺植物生物工程研究所 MCS连杆 五 DNA片段的连接重组 DNA连接酶(DNA ligase) 能催化双链DNA片段紧靠在一起的3’-OH末端和5’-P末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。 目前用于试管中连接DNA片段的DNA连接酶E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。 E.coli DNA连接酶只能催化双链DNA片段互补黏性末端之间的连接； 而T4 DNA连接酶既可用于双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA片段平末端之间的连接。 园艺植物生物工程研究所 * 1.DNA连接酶 * DNA连接酶只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。 园艺植物生物工程研究所 * DNA连接酶利用NAD或ATP中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键。 DNA连接酶 －－NAD+ T4 DNA连接酶 －－ATP （1）具互补黏性末端片段之间的连接 连接反应可用E.coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶； 待连接的两个DNA片段的末端如果是用同一种限制性内切核酸酶酶切的，连接后仍保留原限制性内切核酸酶的识别序列。 如果是用两种同尾酶酶切的，虽然产生相同的互补黏性末端，可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子往往消失了原来用于酶切的那两种限制性内切核酸酶的识别序列。 * 2.DNA片段之间的连接 园艺植物生物工程研究所 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG DNA连接酶 GATCC G G CCTAG + 重组体 目的基因自连 载体自连 2.DNA片段之间的连接 （1）具互补黏性末端片段之间的连接 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 （2）具平末端DNA片段之间的连接 采用核酸外切酶将黏性末端修饰成平末端； 采用末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）将平末端修饰成互补黏性末端。 * （3）DNA片段末端修饰后进行连接 园艺植物生物工程研究所 人工合成的连杆或衔接头 先将连杆连接到待连接的一种或两种DNA 片段的末端，然后用合适的限制性内切核酸酶酶切连杆，使待连接的两种DNA片段具互补黏性末端，最后在DNA连接酶催化下使两种DNA片段连接，产生重组DNA 分子。 * （4）DNA 片段加连杆后连