微生物生化试验[精选].doc

微生物生理生化试验 摘要：本实验通过细菌对生物大分子物质的水解试验、糖发酵试验、IMViC试验几个生化反应证明不同细菌生理生化功能的多样性。生物大分子物质的水解试验证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。糖发酵在肠道细菌鉴定中的重要作用。微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变为深红色，说明胞外存在着脂肪酶。糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸和气体；有些细菌只产酸不产气。发酵培养基含有蛋白胨，指示剂（溴甲酚紫），倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）变为黄色(pH5.2)。气体的产生可由倒置的德汉氏试管中有无气泡来证明。IMViC是吲哚(indol?test)、甲基红(methy1?red?test)、伏一普(Voges-Prokauer?test)和柠檬酸盐(citrate?test)四个试验的缩写，I是在英文中为了发音方便而加上的。这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌(Enterobacter?aerogenes)，多用于水的细菌学检查。吲哚试验是用来检测吲哚的产生。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色(pH6.3)变为红色(pH4.2)，即甲基红反应。 1. 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种：枯草杆菌(Baccillus subtilis)?Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus Rosenbach）、铜绿假单胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)普通变形杆菌Proteus）、产气肠杆菌E.aerogenes）斜面菌种革兰氏染色用卢戈氏碘液(Lugol’s?iodine?solution) 40%KOH，5%α-萘蔡酚，乙醚，吲哚试剂无菌平板，无菌试管，接种环，接种针，试管架?固体油脂培养基，固体淀粉培养基葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各3支(内装有倒置的德汉氏小试管) 蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基将固体淀粉培养基溶化后冷却至50左右，无菌操作制成平用记号笔在平板底部划成四部分。将枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌分别在。将平板倒置在37温箱中培养。观察各种细菌的生长况，将平板打开盖子，滴入少量Lugol’s碘液于平皿中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉己被水解，为阳性。透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。油脂水解试验将溶化的固体油脂培养基冷却至50左右时，充分摇荡，使油脂均匀分布。无菌操作倒入平板，待凝。用记号笔在平板底部划成四部分，分别标上菌名。将上述四种菌分别用无菌操作划接种于平板的相对应部分的中心。将平板倒置，于37温箱中培养。取出平板，观察菌苔颜色，如出现红色斑点说明脂肪水解，为阳性反应。用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌菌名。取葡萄糖发酵培养基试管支，分别接入大肠杆菌，普通变形杆菌，，作为照。另取乳糖发酵培养基试管支，同样分别接入大肠杆菌，普通变形杆菌，，作为对照。在接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。将接种过和作为对照试管均置37培养48h。观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。接种与培养将上述二菌分别接种于支蛋白胨水培养基(吲哚试验),支葡萄糖蛋白胨水培养基(甲基红试验)，置37培养2d。观察(1) 吲哚试验??于培养2d后的蛋白胨水培养基内加3~4滴乙醚，摇动数次，静置1~3min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。() 甲基红试验??培养2d后，将l支葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变黄色者