动物细培养实验设计.docVIP

动物细胞培养技术 实验报告 生物技术1004班 第四组 实验一 仪器的清洗与灭菌及培养基的配制 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。常用的消毒灭菌方法有： (1)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。 (2)湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。 (3)滤过除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。以0．22 μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。(4)化学消毒法 70％(或75％)酒精：超净台里常备70％酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。 三、实验材料、用品 1．材料：???PH试纸、三蒸水、量筒 烧杯（1000ml 2个250ml 4个100ml2个10ml 3个）、玻璃棒（3个）、250ml盐水瓶（8个）10ml盐水瓶(10个) 250ml玻璃螺口培养瓶（27支） 1.5ml离心管一瓶 微量可调移液器3个（1000ul配套枪头2盒） 注射滤器（0.22微米微孔滤膜）（4只） 带旋盖离心管10ml （3个）、离心管架一个 1把小镊子，3把剪刀，3把弯镊 3个100目钢丝筛网 牛皮纸 橡胶皮筋 标签纸 记号笔若干 2．药品：75％酒精，DMEM培养基试剂干粉一包、胰蛋白酶250mg，青霉素、链霉素（双抗液0.3g) KH2PO4 ，NaCl，NaHCO3 ，KCl ，葡萄糖Na2HPO4.H2O?? 3．仪器：超净台，高压蒸气灭菌锅，磁力搅拌器、电子天平。 四、实验步骤 (一)仪器的清洗与灭菌 玻璃器皿（16支250ml玻璃螺口培养瓶、3个培养皿、10ml小烧杯3个 ） 1．玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡30分钟 2．用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次，倒置自然干燥。 3．包装(牛皮纸或一般纸)，要标明班级及小组，防止混用丢失。 4．高压蒸汽灭菌。 5．贮存备用。 金属器械（1把小镊子，3把剪刀，3把弯镊 3个100目钢丝筛网 ） 1．先用清水清洗之后再用洗洁精清洗。 2．用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次，倒置自然干燥。 3．包装(牛皮纸或一般纸)，要标明班级及小组，防止混用丢失。 4．高压蒸汽灭菌。 5．贮存备用。 塑料制品（1.5ml离心管一瓶 1000ul配套枪头2盒 ） 1．用洗涤剂清洗塑料制品，自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次，倒置自然干燥。 2．包装(牛皮纸或一般纸)，要标明班级及小组，防止混用丢失。 3．高压蒸汽灭菌。 （二）试剂及培养基的配制 1. 水： 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水. 2. Hanks液的配制（《动物细胞培养技术》28页： （1）甲液 KCl 0.04g 1甲液搅拌溶解，乙液单独溶解。 Na2HPO4.H2O??0.06g 2将乙液徐徐加入甲液中。 KH2PO4 0.06g 3将0.35g NaHCO3 单独溶解到37℃ 100ml三蒸水中 MgSO4`H2O 0.20g 4用数滴NaHCO3液溶解0.02g酚红 葡萄糖 1.00g 5将(3) (4)液移入甲乙混合液中 NaCl 8.00g 6用三蒸水定容至1000ml，充分混匀调pH到7.4，膜 三蒸水