高效液相色谱法要点.pptVIP

2、无机基质 ①多孔硅胶 ②可控孔径玻璃 3、高效亲合色谱兼具亲合色谱和高效液相色谱 的特点 ①可以提高效率，还可以改善回收产物纯度和 浓度 ②检测灵敏度得以大幅度提高 ③具有更高的选择性 ④配基结合的牢固性也可以延长填料的寿命并 提高产物的质量，这对生物工程的分离、纯化 工作是非常有利。 三、亲合色谱影响因素 1、平衡和平衡缓冲溶液 选择平衡缓冲溶液所具有的PH值，离子强度， 温度和化学组成都应使配体与蛋白质之间能发 生比较强的相互作用。 2、蛋白质的浓度和温度效应 ①对亲合力一般或较高的蛋白质，其互补酶的浓 度对亲合容量的影响不明显，柱顶端结合的大分 子与最初加入的大分子浓度无关。 ②温度效应在亲合色谱中非常重要，因为亲合 填料吸附作用的强度随温度升高而降低。 3、特异性洗脱 通常选用对纯化的活性分子有高的亲合力，但 其结构与填料上的配体不同的配体来洗脱，这 样就保证了吸附和洗脱双重特异性，使非特异 性洗脱减少到最小程度。 4、非特异性洗脱 非特异性洗脱主要受缓冲溶液中的PH值，离子 强度，温度和介电常数的控制。 第十节 色谱分离方法的选择 一、相对分子量 ①分子量＞2000，凝胶色谱柱 ②分子量2000，但同时分子量相差＞10%， 凝胶色谱柱 ③分子量＜2000的水溶性电解质，酸性物质用 阴离子交换树脂，碱性物质用阳离子交换树脂 ④分子量＜2000的水溶性非电解质，选用反相 色谱法 ⑤分子量＜2000的非水溶性物质，弱极性物质 选用反相色谱法，极性物质选用正相色谱法。 二、溶解度 水溶性样品 离子交换色谱或液-液分配色谱 微溶于水，但在酸或 碱存在下能很好离心 的化合物 离子交换色谱 油性样品 液-固色谱法 相对非极性化合物 液-固色谱法 三、化学结构 结构特点 分离方法 离子型化合物 离子交换色谱，空间排阻和液-液分配色谱 异构体 液-固色谱法 同系物 液-液分配色谱 高分子聚合物 空间排阻色谱法 2、流动相的离子强度 四、离子交换色谱的影响因素 1、填料孔径的影响 2、柱长的影响 3、流速的影响 4、PH值的影响 无论在强的还是弱的阴离子交换柱上，蛋白质 均显示不同PH值影响结果，因此决定了它的保 留选择性、分离度和回收率等因素。 5、离子强度的影响 第八节 体积排阻色谱法 一、分离机理 1、体积排阻色谱法（SEC） 或空间排阻色谱法（SEC） 或凝胶色谱法 2、凝胶过滤色谱法（GFC） Sephadex 葡聚糖凝胶 3、凝胶渗透色谱法（GPC） 4、空间排斥理论 ① ② V0 死体积，相当于凝胶的粒间体积 Vs 色谱柱中凝胶的孔穴总体积 二、体积排阻色谱法的特点 三、体积排阻色谱法的固定相 （一）固定相的分类 1、按固定相基质分类 2、按固定相机械强度分类 （二）凝胶固定相的特性参数 1、渗透极限 2、分离范围 3、固流相比 在SEC中常将柱中凝胶孔体积中的溶剂称为 固定相，而将柱中凝胶颗粒间空隙体积中称为 流动相，而凝胶孔体积与凝胶颗粒间空隙体积 的比值称作固流相比。 4、柱效 （三）凝胶色谱柱的制备及谱图的特点 ①物理因素——影响凝胶色谱柱的性能 ② 扩大分离范围——使用两根以上的串联色谱 柱。 ③更换流动相 谱图的特点：在凝胶渗透色谱中，对不同分子量 聚合物色谱峰的谱带展宽不同于其它液相色谱。 ① 在低效排租色谱法，样品分子大小随V的增加 而急剧减小，而柱效却随样品分子量的增加而增 大因此在色谱图上，不同分子量组分的谱带宽度 保持不变。 ② 在高效排租色谱法，峰宽却是个变量。 四、体积排租色谱法的流动相 在体积排租色谱法中，流动相的性质对保留值 和分离选择性无影响。 ① 溶解样品的良溶剂 ② 低黏度溶剂 ③ 柱填料不能在溶剂作用下收缩或溶胀 ④ 控制流动相的PH值和离子强度 ⑤ 凝胶渗透色谱——示差折光检测器 流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率 有较大的差别。 凝胶过滤色谱——紫外吸收检测器 使用在检测波长无紫外吸收的溶剂作流动相。 （一）凝胶渗透色谱的流动相 凝胶渗透色谱常采用甲苯，四氢呋喃和氯仿等 有机溶剂作流动相。 在用于高聚物分子量测定的凝胶渗透色谱中， 四氢呋喃是最常用的流动相，它对样品有良好 的溶解性能和低的黏度，并可使小孔径聚苯乙烯凝胶溶胀，因此被优先推荐使用。 （二）凝胶过滤色谱的流动相 在凝胶过滤色谱中，使用以水作基体具有不同 PH值的多种缓冲溶液作流动相。 五、体积排租色谱的影响因素 1、填料 ① 化学键合的硅胶 ② 亲水树脂凝胶 2、柱长 体积排租色谱的分离度与柱长的平方根成正比。 3、洗脱液 ① 以硅胶为基质的填料，PH值范围在2.0-8.0。 ② 键合硅胶如TSK系列凝胶柱在分离蛋白质时 保留时间主要取决于填料表面上的硅醇基与离 子的反应。